2020 Fiscal Year Research-status Report
優れた抗炎症作用を有する植物乳酸菌由来細胞外多糖体の構造活性相関の解明
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20K07099
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
野田 正文 広島大学, 医系科学研究科(薬), 特任准教授 (40457289)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉山 政則 広島大学, 医系科学研究科(薬), 共同研究講座教授 (30106801)
杉本 幸子 広島大学, 医系科学研究科(薬), 准教授 (60549012)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | プロバイオティクス / 乳酸菌 / 抗炎症 / 細胞外多糖体 / 潰瘍性大腸炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、生物活性に変化を生じた変異細胞外多糖体 (exopolysaccharide, EPS) を産生する植物乳酸菌Lactobacillus paracasei IJH-SONE68の変異株を取得すべく、実験を行った。
まず、エラープローンPCR法により、既知のIJH-SONE68株における2つのEPS生合成クラスターを基に、変異クラスターのクローニングを試みた。市販されている複数のPCR酵素を用いて増幅を試みたが、一方のクラスターの増幅しか確認されず、また増幅断片の大腸菌/乳酸菌シャトルベクターへの挿入が困難であったことから、変異導入剤を用い、IJH-SONE68株のEPS産生性変異株を取得する方針に実験計画を変更した。現在、変異株の取得を試みている。
一方、本EPSの新たな保健機能性を探索すべく、スクリーニングを行った。Caco-2細胞を用いた腸管上皮細胞モデルにおいて、サルモネラおよびカンピロバクター由来リポ多糖 (lipopolysaccharide, LPS) の刺激により誘導される炎症性サイトカインIL-8の産生を、IJH-SONE68株由来EPSが抑制することが確認された。本アッセイ系は今後の変異EPSの抗炎症活性評価に活用していきたい。
加えて、上記の抗炎症作用が確認されたことを踏まえ、自己免疫疾患のひとつと考えられている指定難病のひとつ、潰瘍性大腸炎に対する本EPSの効果について、モデルマウスにより評価を行った。その結果、本EPS、特に酸性EPSの摂取によって、炎症性サイトカインMIP-2 (マウスでのIL-8ホモログ) 産生の減少と、抗炎症性サイトカインIL-10産生の上昇が認められ、潰瘍性大腸炎における諸症状の緩和も認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り進めることが困難であると判断した変異クラスターのクローニングに関しては、変異導入剤によるミュータント取得による実験法にシフトし、継続している。過去にも同じくEPS産生性ではあるが、生合成遺伝子クラスター未同定の乳酸菌株において、ミュータント取得実験は実施した経験があり、手技に関しては問題ない。
また、新型コロナウイルス感染症拡大に伴い、取引のあったカイコ購入先が販売を中止してしまったが、代わりに抗炎症に着目したin vitroアッセイ系を新たに構築することに成功した。また、IL-8の産生抑制効果を踏まえて実施した潰瘍性大腸炎モデルマウスに対する実験においても、その予防改善効果が確認された。
構築したin vitroアッセイ系と炎症性疾患に対する予防改善効果のリンクが認められたことから、本アッセイ系を用いることでより実際の抗炎症作用を反映したスクリーニングが実施可能となると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
速やかにミュータントの取得を進め、令和二年度に確立したアッセイ系を利用して活性に変化のある変異体の収集を行い、令和三年度の計画通り、EPS生合成遺伝子クラスター上の変異について網羅的に解析を行っていく。この際、新たに確立したアッセイ系は炎症性疾患に対する予防改善効果と強い相関を示すと考えられるため、動物実験による再検証は省き、令和四年度に計画していた抗炎症作用の作用機序解明にいち早く着手できると想定している。
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| Causes of Carryover |
研究分担者がモデルカイコを利用した活性評価試験を実施予定であったが、新型コロナウイルス感染症の影響で、取引のあった実験用カイコの購入先が販売を中止し、それに伴い予定していた物品費に次年度使用が生じた。カイコを用いたアッセイ系については、より抗炎症活性を反映すると考えられる、令和二年度に新たに確立したin vitroアッセイ系に切り替えて実施していく予定であり、それに伴う消耗品購入の費用として使用する計画である。
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