2021 Fiscal Year Research-status Report
発酵工学を利用した抗嫌気性菌活性物質ルミナミシンの非天然型誘導体の創製
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20K07105
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
稲橋 佑起 北里大学, 感染制御科学府, 講師 (70645522)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣瀬 友靖 北里大学, 感染制御科学府, 准教授 (00370156)
松井 秀仁 北里大学, 大村智記念研究所, 研究員 (80503797)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ルミナミシン / Clostridioides difficile / 生合成 / 放線菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ルミナミシンの生合成における無水マレイン酸含有14員環ラクトン（ノーザンパート）とシスデカリン含有10員環ラクトン（サザンパート）のカップリング機構の解明を目的に、ルミナミシン生合成遺伝子クラスターに存在するシトクロムP450 (LumP3, LumP4) 、エステラーゼ (LumI) の遺伝子および無水マレイン酸部位の生合成に関与すると推定したLumR/Sの遺伝子欠損株の代謝産物の解析を行なった。lumP3欠損変異株及びLumP4欠損株ではそれぞれ野生株では生産されていない化合物があったため、それらを各種クロマトグラフィーおよびHPLCにて単離精製した。さらに、単離した化合物についてNMRを用いて、その構造解析を行なった。それら化合物の構造はルミナミシンと比較して、ノーザンパートに大きな違いが見られていた。一方、取得した化合物についてC. difficile活性を測定したが、いずれの化合物も活性を示さなかったため、ノーザンパートもしくは、ノーザンパートとサザンパートを合わせた全体構造が活性に重要であることが考えられた。lumP3欠損株から取得した化合物をlumP4欠損株に添加してもルミナミシンへの変換が見られなかった一方、lumP4欠損株から取得した化合物をlumP3に添加するとルミナミシンへの変換が見られたことから、生合成の順番としてLumP4の次にLumP3が反応することが示唆された。今後は単離した化合物を用いて酵素反応試験を行うとともに、他の遺伝子の欠損株も作成し、その代謝産物解析ならびに生合成中間体の取得を試みる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
lumP3欠損株とlumP4欠損株が生産する生合成中間体（もしくはシャントプロダクト）の取得に成功し、その構造を明らかにでき、ルミナミシンの生合成経路のヒントが得られた。まだカップリング機構については不明な点が多いため、他の遺伝子の欠損株から生合成中間体を取得したり、酵素反応を行うことで、その解明に取り組みたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
ルミナミシン生合成遺伝子クラスターの全長が得られていないため、今後、シークエンス解析を行い遺伝子クラスターの全長を得る。
LumP3欠損株、LumP4欠損株以外の欠損株からも生合成中間体を単離し、その構造解析を行う。また、生合成中間体を用いて酵素反応によりその生合成酵素の機能を解明する。
生合成遺伝子改変により10員環ラクトン部位の類縁体を作製する。一方、有機合成により無水マレイン酸部位の類縁体を作製する。それぞれの部位をカップリンさせることで、非天然型ルミナミシン誘導体合成を試みる。また、得られた誘導体のC. difficileに対する抗菌活性を測定する。
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| Causes of Carryover |
前年度からの新型コロナウイルス感染症の拡大に伴い、全体の研究に遅れが生じている。生合成遺伝子クラスターで解読出来ていない領域について、シークエンスを行い解読する。二次代謝産物生合成遺伝子の欠損変異株作製や、作製した変異株の代謝産物解析を行い、生合成中間体の取得を試みる予定。それに使用する生化学実験用試薬やシークエンス解析費用、化合物の単離精製のための有機溶媒やカラムなどの消耗品に予算を使用する予定。
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