2020 Fiscal Year Research-status Report
くも膜下出血合併症予防・治療薬の天然物からの探索と開発
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20K07123
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| Research Institution | Microbial Chemistry Research Foundation |
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Principal Investigator |
和田 俊一 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 研究員 (40450233)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奈良岡 征都 弘前大学, 医学部附属病院, 講師 (10455751)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | くも膜下出血 / トレハロース / レンツトレハロース / 溶血液 / 放線菌 / 天然物 / 抗酸化物質 / 食品植物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
くも膜下出血合併症の予防、治療薬として有望な化合物を探索するために、培養細胞、マウス、およびウサギを用いた評価系の構築について検討を行っている。培養細胞については、患部での出血による組織へのダメージをできるだけ再現しつつ、ハイスループットな探索にも応用できるように簡易化された系となるよう、神経細胞のモデルとして神経芽細胞腫株を、免疫細胞のモデルとしてミクログリア細胞株を用い、溶血液処理によるダメージを測定、評価できる系を構築し、現在は細部諸条件の改良について検討中である。マウスの系については所属研究機関動物施設の支援のものと、脳内出血モデルの構築を検討している。培養細胞を用いた探索では多数のヒットサンプルが得られるものと予想されるが、マウスでは、ウサギの実験に使用する数サンプルを選ぶために、多サンプルの評価が簡単に行える系の構築を目指している。マウスでのくも膜下出血の再現は現在のところ技術的に困難であったため、現在は脳内出血モデルを構築し、ダメージの評価系として適したものについて検討中である。ウサギの実験は、共同研究者の弘前大学脳神経外科学講座のグループが行う。できるだけヒトのくも膜下出血に近い系の構築を目指し、評価対象化合物については、実際にヒト患者の治療を行う同グループにより、治療薬としての適正を見極め、開発につなげる。開発候補化合物の一群として、これまでに発見、開発検討をしてきたトレハロース類縁体化合物レンツトレハロース類について、引き続き物性や細胞への影響を検討している。今年度はTRH-X (未発表、特許出願予定のため仮名)を中心に検討を行い、特許出願、論文発表の目途が立った。また、くも膜下出血治療薬として有望な化合物の探索源として、抗酸化物質や抗炎症物質を多く含み、人体への安全性の高さも期待できる食品植物ライブラリーを新たに構築中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
培養細胞を用いた評価系の構築においては、使用に適した細胞株（神経芽細胞腫株とミクログリア細胞株、それぞれ1種ずつを基本使用株とする）の選出、使用する溶血液の動物種(ウマまたはウシ)や作製法の検討、ポジティブコントロール化合物（エダラボン）の選定と使用法の確立、細胞へのダメージの検出法 (H2DCFDAによる細胞内活性酸素量の評価)などについて検討し、今後の薬剤探索実験に使用できそうな系が概ね構築できた。マウスを用いた評価系については、当初はくも膜下出血の再現を試みたが、対象部位が狭小で血液の注入が困難であり、多サンプル用の評価系として継続的に使用できる見込みが得られなかった。そのため、くも膜下出血とは患部の分子、細胞、および組織の、状態や挙動に共通点が多く、モデルの構築、使用が簡単な脳内出血の系を構築することにした。また、ダメージの評価法としては、今のところRotarodを使用した運動機能の評価を行っているが、投入した血液によるダメージが少なく結果が多少不明瞭である。今後、より強い毒性を発揮する血液（溶血液）の投与法の開発や、他の評価系の導入を検討する必要がある。ウサギの評価系については弘前大学において既に遅発性の血管攣縮を伴うくも膜下出血のモデル系を構築済みである。しかしながら、新型コロナウイルス感染症の影響で現在弘前へのウサギの搬入が困難となっているため、評価実験については延期としている。TRH-Xについては、本年中の特許出願、本年度中の論文投稿の見込みである。また、食品植物ライブラリーについては、スパイス、ハーブ、シード、およびシードを発芽させたスプラウト類を中心として、通年で常時入手可能なサンプル177品目を集め、脂溶性の程度が異なる4種の溶媒で順次抽出した700種余りの抽出液を用意し、随時、くも膜下出血治療薬の探索に使用できる状態としている。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養細胞の評価系に関しては、今後の多サンプルのスクリーニングへの応用を見越して、作業の簡易化やコストダウンのために、溶血液調整法や処理法などにおいて細部の調整を行い、その後、食品植物ライブラリーや微生物抽出物ライブラリーからの有用物質の探索を行う。マウスの実験では、今のところ注入する血液による毒性の低さや、多サンプルの評価に適した簡易な評価系の選定が課題となっている。毒性については、今後、血液より強い毒性が見込まれる溶血液の使用、瀉血による虚血状態への血液注入、血液注入後の加温、あるいは支持担体の利用による血腫の患部への残存、などを試し、向上をはかる。一方、測定法に関しては当面Rotarodによる評価を中心として続けるが、適宜、ＬANケーブルを用いた詳細な行動評価や、色素染色や切片染色によるダメージや酸化ストレスの評価なども検討していく。ウサギの評価系に関しては、新型コロナウイルス感染症の落ち着いた状況をみて再開する。まずはレンツトレハロースA、TRH-X、およびＴRH-Ｘ誘導体化合物TRH-Yの評価を予定している。レンツトレハロース類に関する研究では、くも膜下出血治療効果において重要と思われる抗炎症作用に関する作用機構について検討を行う。特にこれまでに検討してきたオートファジー誘導作用との関連について検討を予定している。また食品植物ライブラリーについては、サンプルを増やしていく。このライブラリーを用いて既に既存の抗菌剤探索や抗腫瘍剤探索の評価系によるスクリーニングを行っており、幾つか有望なサンプルが得られている。これらについても並行して検討、開発を進めていくが、今後は培養細胞評価系の準備が整い次第、くも膜下出血治療薬探索のためのスクリーニングを開始し、それを主として進めていく。
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| Causes of Carryover |
初年度は緊急事態宣言中の出勤調整により勤務時間が短縮されたため、研究時間も短くなり通常より研究費の使用額が少なかった。また、急な外出自粛要請などに備えて長期間継続する実験作業や使用期限の厳密な試薬、キット類を使用した実験を始めにくい状況でもあった。所属機関の緊急事態宣言への対応として2回目以降は若干出勤調整が緩和されたため、次年度は通常に近い形で実験を行うことが可能となる見込みであり、初年度に控えていた実験も随時行っていく予定である。次年度使用額として繰り越した額は主にこれらの実験の遂行や、試薬、キット類の購入のために充てる。
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Research Products
(1 results)
