ユビキチンリガーゼ活性を制御するmiRNAのパーキンソン病治療に対する有用性検証

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07154
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 大村 友博 神戸大学, 医学部附属病院, 准教授 (00439035)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ユビキチンリガーゼ / パーキンソン病

Outline of Annual Research Achievements

パーキンソン病（PD）治療ではレボドパによる対症療法が主であり、新たなメカニズムに基づく治療薬が期待されている。申請者はこれまでPDと小胞体ストレス関連ユビキチンリガーゼHRD1、安定化分子SEL1Lとの関連性について研究を行ってきたが、近年microRNA（miRNA）がこれら分子の発現を制御する可能性が示唆されている。そこで、PDモデル細胞を用いて、HRD1-SEL1Lを制御するmiRNAを探索したところ、SEL1Lの発現を制御する可能性があるmiRNAとしてmiR-101を見出した。今回、miR-101によるSEL1Lの機能制御メカニズムについて検討した。
まず、miR-101の標的サイトを含むSEL1L 3’-非翻訳領域（3’-UTR）の一部を挿入したレポーターベクター（野生型）、または標的サイトに変異を導入したレポーターベクター（変異型）を構築した。次にヒト神経細胞SH-SY5YにレポーターベクターとmiR-101 mimicを遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイを行うことでmiR-101とSEL1L 3'-UTRが相互作用するか検討した。その結果、miR-101 mimicと野生型SEL1L 3'-UTRを遺伝子導入した場合、ルシフェラーゼ活性が有意に低下したが、変異型SEL1L 3'-UTRの場合、変化は認められなかった。また、miR-101を遺伝子導入すると、PDモデルで誘導されるSEL1Lの蛋白質発現量上昇が有意に抑制されることが明らかとなった。
以上より、miR-101はSEL1L 3'-UTRの標的サイトと直接作用し、SEL1Lの蛋白質発現量に影響を与えることが示唆された。今後は、HRD1を制御するmiRNAをin silicoで探索し、抽出したmiRNAがHRD1を制御するかについてルシフェラーゼアッセイ等を用いて検討する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2020年4月から数か月間、コロナ禍の影響でほとんど研究を行うことができなかったためであるが、夏以降はある程度順調に進んでおり、研究計画に基づいて鋭意進行中である。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度は、HRD1を制御するmiRNAをin silicoで探索し、抽出したmiRNAがHRD1を制御するかについてルシフェラーゼアッセイ等を用いて検討する予定である。また、今回抽出されるmiRNAとmiR-101が、PDモデルにおいてどの程度細胞死に寄与するか、HRD1/SEL1Lの関与も考慮したうえで検討する。

Causes of Carryover

令和2年度に行う実験の一部を令和3年度に行うことになり、その分が執行されなかったため、残額が生じた。
令和3年度はHRD1を制御するmiRNAをin silicoで探索後、PDモデルにおいて変化するか否かを検討する予定であり、それらに必要なリアルタイムPCR試薬などを購入する予定である。