探索的薬物動態研究に資する高い薬物代謝機能を発現したヒト代替肝細胞の培養系構築

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07161
• Research Institution: Nihon Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 山田 泰弘 日本薬科大学, 薬学部, 教授 (80464551)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ヒト代替肝細胞 / ヒト肝癌由来細胞 / DNAメチル基転移酵素阻害剤 / HepG2細胞 / Huh-7細胞 / シトクロムP450 / グルクロン酸転移酵素 / 硫酸転移酵素

Outline of Annual Research Achievements

創薬研究での薬物動態と毒性評価に資するヒト代替肝細胞（ヒト肝細胞様細胞）を創製するために、ヒト肝芽腫由来細胞株のHuh-7細胞またはヒト肝癌由来細胞株のHepG2細胞をDNAメチル基転移酵素（DMNT）害剤である5-アザシチジン（5-Aza）でエピゲノム化処理することにより、第I相反応酵素である7種類のシトクロムP450（CYP1A2, 2B6, 2C8, 2C9,2C19, 2D6, 3A）分子種および第II相反応酵素であるグルクロン酸転移酵素（UGT）と硫酸転移酵素（SULT）活性を高発現させるための最適培養条件について検討中し、明らかにした。
今年度は以下の4項目について検討した。① 5-Aza処理の最適濃度は、HepG2細胞では2.5 μMであり、Huh-7細胞では10 μMであったが、処理後の薬物代謝酵素活性の発現誘導効果を両細胞間で比較すると、Huh-7細胞の方が明らかに低く、またHepG2細胞で認められたCYP2B6とCYP2C8の発現誘導が全く認められなかった。② HepG2細胞の5-Aza暴露処理中のDMEM培地中グルコース濃度について検討したところ、高グルコース濃度よりも低グルコース濃度の培地の方がより高い薬物代謝酵素活性の発現が認められた。③ HepG2細胞の5-Aza暴露処理中のDMEM培地へのDMSO添加の効果を検討したところ、CYP3AとUGT酵素活性においてより高い発現が認められたが、他の薬物代謝酵素活性は低下する傾向が認められた。④ 5-aza処理HepG2細胞の薬物代謝酵素機能を維持するための培養培地について、従来のDMEMと市販の3種類のヒト肝細胞培養培地で比較検討したところ、各培地において各薬物代謝酵素ごとに活性の維持能力に多少の違いはあったが、コストパフォーマンスと全ての薬物代謝酵素活性を考慮すると、DMEM培地での培養が推奨される。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

主に下記の2つの要因により、進捗状況がやや遅れている。
１．5-Aza処理による薬物代謝酵素の発現には、4～5週間の培養暴露期間が必要とするが、この培養期間中に何らかの操作ミスが生じてしまたために、最初からの培養操作のやり直しと再現性の検討などを行うことが必要となった。
２．培地に加えるサプリメントや培養するための器具類などの供給が遅延したために、研究実施の開始を遅らせることが起きた。

Strategy for Future Research Activity

DMNT阻害剤による薬物代謝酵素の発現誘導効率を高めるために、下記の項目について検討する予定である。
１．最も効率よく薬物代謝酵素を高発現させるDMNT阻害剤の検討。
２．DMNT阻害剤によるエピゲノム処理の効率を高めるための培養培地とサプリメントの検討。
３．薬物代謝酵素機能をより高く発現させるための三次元培養を含む新規培養法の検討。
４．ヒト代替肝細胞を創薬研究へ活用するためのアプリケーションの構築。

Causes of Carryover

培地へ添加するサプルメント、凍結ヒト肝細胞および培養デバイスなどの国内在庫が無く、今年度の購入ができなかったので、次年度の予算で下記の製品などを購入し検討を行う。
・代替ヒト肝細胞の薬物代謝酵素活性を初代培養ヒト肝細胞の薬物代謝酵素を比較するために、凍結ヒト肝細胞を購入。
・三次元培養を含む新規培養デバイスや培地および試薬・器具類を購入。
・薬物代謝酵素活性をLC-MS/MSで測定するための器具類、基質およびその代謝物、内部標準物質などを購入。