2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of autovaccine for periodontal disease using human salivary exosomes with immune activity
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20K07162
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| Research Institution | Teikyo Heisei University |
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Principal Investigator |
小川 裕子 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (30267330)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | exosome / 唾液 / DPP IV / マクロファージ / 免疫活性化 / 細胞外小胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者が見出したヒト唾液由来のexosome様の細胞外小胞(Exo)による免疫活性化機構を明らかにし、歯周病自家ワクチン療法への応用を目指している。本Exoは、口腔内細菌の成分(LPS)および免疫活性化因子(ジペプチジルペプチダーゼIV；DPP IV)を含有する（LPS/DPP IV-Exoと称する）。本Exoはおそらくマウスマクロファージ（Mφ）を古典的活性化経路により活性化させるが、その一酸化窒素（NO）およびサイトカインの産生能はLPS単独での添加よりも抑制されていた。本ExoによるMφ活性化の抑制は、Exoによる抗体産生能に寄与する可能性がある。そこで本ExoによるNO産生機構を明らかにするため、Exoに存在するLPS結合タンパク質の探索を行った。同定された複数の候補タンパク質について、Mφへの単独添加またはLPSとの共添加を行い、NO産生を抑制させるタンパク質を見いだした。
並行して、Exoの作用発現に重要である表面に存在する分子を解析し、Exoの膜に強固に結合し、免疫沈降により唾液から直接Exoが抽出可能な膜タンパク質とリクロマトグラフィーにより除去される外層のようなタンパク質があることが判明した。リクロマトグラフィー後はExoからのNO産生量およびDPP IV活性は増強されることも見いだした。以上のことはこれまでに見出した、Exoが消化管内で外層が消化されると共にNO産生量が増加するという知見と一致している。従って、唾液由来Exoは口腔内ではそのMφ活性化作用を抑制され、消化管内に到達して免疫活性化等の機能を発揮する可能性があると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はLPS/DPP IV-Exoによる免疫活性化機構の全貌の解明を予定していた。LPS結合レジンを用いた本Exoのプルダウンアッセイにより、LPS結合タンパク質の探索を行った。その結果、唾液中に存在することが知られているLPS結合タンパク質3種類および従来LPSへの結合は報告されていないタンパク質1種類が同定された。これらの組換えタンパク質をMφに添加すると、4種類のタンパク質のうち、少なくとも2種類はLPSによるNO産生を阻害した。さらに、これらタンパク質について、唾液由来LPSおよび歯周病菌が結合するかを検討した。唾液由来LPSは同定した全てのタンパク質が結合したが、歯周病菌由来のLPSに結合する可能性があるタンパク質は1種類であった。歯周病菌由来のLPSは他の細菌由来のLPSと構造が大きく異なり、トール様受容体4（TLR4）との結合能が弱く、サイトカインの誘導能も低いことが知られている。歯周病菌由来LPSに結合した本タンパク質は、炎症に関与することが知られている一方、MO産生の抑制にも関わる可能性があり、Exoによる免疫活性化の鍵となる可能性がある。また本タンパク質の抗体を用いた免疫沈降により、このタンパク質が膜タンパク質としてEV表面に存在していることを確認した。
細胞外小胞は体内でMφに集積しやすいことから、本Exoを蛍光標識してMφに添加後、顕微鏡観察を行い、Mφに取り込まれることを確認した。以上のことから、本Exoの作用としてMφ表面の受容体を介するNO産生を始めとする活性化作用およびMφ内に取り込まれた後に機能を発揮する可能性があることが示唆された。
研究計画のうち、免疫活性化機構の解明に関して未だ課題が残っているが、LPS結合タンパク質が同定されたことから、おおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度はLPS/DPP IV-Exoによる免疫活性化機構を精査すると共に、本Exoの歯周病菌LPSに対する作用を検討する。得られた候補タンパク質を細胞表面に発現する培養細胞株を使用し、候補タンパク質をノックダウン後に分泌される細胞外小胞（EV）を調製して、Mφへの作用を元の細胞株由来のEVと比較する。さらに、本EVが歯周病菌由来LPSと結合するか、結合は候補タンパク質によるものかをプルダウンアッセイで検討する。並行して唾液由来LPS/DPP IV-Exoについて、同定されたLPS結合タンパク質の中和抗体または阻害剤を用いて、MφのNO産生及び炎症性サイトカイン産生への影響を調べる。この際、IgA産生の可能性についても検討する。
体内動態については、本ExoのMφへの取り込み後の作用を検討する。Mφとして培養細胞株RAW264.7細胞およびマウス腹腔内Mφを用い、唾液由来LPS/DPP IV-Exo添加後の経時的な免疫蛍光染色により、局在するオルガネラを同定する。並行して、同定されたLPS結合タンパク質の組換えタンパク質またはLPS（唾液由来または歯周病菌）を蛍光標識後、両者の複合体を生成させてMφに添加し、細胞内の局在を本Exoと比較することで、LPS結合タンパク質とMφへの取り込みとの関連性を調べる。
最終的には歯周病菌由来LPSを結合させた培養細胞株由来のEV（結合しない場合はLPS/DPP IV-Exo）またはこれを模したリポソーム（LPS結合タンパク質を表面に有した状態でLPSを添加して結合させたもの）を調製してマウスまたはラットに経口または経鼻投与し、経時的に外分泌液（唾液、腸液等）を回収し、NO産生量、sIgAおよび炎症性サイトカインの分泌量を測定して比較する。分泌されたsIgAについては、LPSへの結合性をELISAにより検討する。
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| Causes of Carryover |
見積もり後に予定より安価となったため、残高が発生した。次年度の備品購入費とする予定である。
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