2020 Fiscal Year Research-status Report
A novel approach for analyzing the three-dimensional dynamics of cell motility by the combined use of scanning ion conductance microscopy and machine-learning
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20K07217
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
水谷 祐輔 北海道大学, 総合IR室, 特任准教授 (40646238)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三上 剛和 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80434075)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | イオンコンダクタンス顕微鏡 / 細胞質突起 / 機械学習 / 画像解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）を用いて取得できる生きた細胞の頂上膜面の細胞質突起の画像からダイナミクスを解析し，そのダイナミクスと細胞機能の関係性を解明することを目的としている。そのダイナミクスの解析には，本研究を通して構築する機械学習を用いたコンピュータ支援構造判別評価システムを使用し，困難さを多く含む画像判別を自動化することでより効率的におこなう事を並行して実施するものである。
本年度については以下に示す課題に取り組んだ。
1. 画像データセットの収集と機械学習用データの準備およびシステムの構築： 申請者は現在までに各種実験を通して撮像したSICM像を所有していることから，その収集および本研究に使用するものを選別しタグ付けをおこなった。また，システムの構築は，フリーウエアで構築を進め，テスト画像等を処理させるなど適したものの選定をおこない，機械学習をおこなえる作業環境整備を進めた。
2. Ca9-22細胞の細胞質突起の構造観察： SICMを用いた画像取得は，探針であるガラスピペットの形状や細胞の状態に依って適した画像取得に関するパラメータは異なるが，Ca9-22細胞の細胞質突起の観察における条件を精査することで，現状において適した画像取得パラメータを見出した。
3. Tet受容体を恒常的に発現する細胞の樹立： 遺伝子導入により細胞質突起構造の遷移状態をコントロール可能なCa9-22細胞の作製を試みた。まずTet受容体発現ベクターをCa9-22細胞へ導入し，G418にてTet受容体恒常発現細胞をセレクションした。その後，ウエスタンブロット法にてTetの発現を確認したが，発現していても数日で発現が消失，もしくは発現が認められないことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
機械学習を用いた構造判別評価システムを構築するために，画像データセットの収集と機械学習用データの準備を進めている。その上で，画像処理用ライブラリ，機械学習ライブラリなどが適しているか検討をおこない，その結果，テスト画像を用いた画像処理がおこなえることを確認した。所有しているSICM像の収集および本研究に使用する画像の選別，タグ付けについてまだ完了していないが，収集したSICM像のデータセットを用い，機械学習を実行し，これにより細胞表面にある細胞質突起構造識別のアルゴリズムを作成できるよう，着実に進めている。
また，細胞質突起の性状が異なる状態およびその遷移過程の評価をおこなうために用いる細胞の作製にも着手している。本件については，特定の発現を ON/OFFするためにテトラサイクリン発現誘導システムを用いて，ドキシサイクリン応答性における目的遺伝子発現をおこなえるCa9-22細胞の作製を開始した。Ca9-22細胞へTet受容体発現ベクターをトランスフェクションし，ウエスタンブロット法にてTetの発現を確認している。しかしながら，発現していても数日で発現が消失するなど，安定化細胞の樹立までには至っておらず，改良をおこなう必要があり，対応中である。
これらを総合して，計画全体としてはおおむね順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の本研究課題を滞りなく進めていくためには，SLPIの発現の ON/OFFがおこなえるCa9-22細胞の作製を引き続き進め，できるだけ早い段階での安定化細胞の樹立が重要である。発現が消失する原因は，標的遺伝子の発現を誘導するCMVやSV40などのプロモーターが細胞への導入後にメチル化修飾を受けての不活化であると考えている。また，形質転換体を選択するための薬剤耐性遺伝子の発現が標的遺伝子と異なるプロモーターで誘導されることから，薬剤耐性をもつクローンであっても標的遺伝子を発現していない場合がある。そこで，恒常的にTet受容体を発現し,薬剤耐性と標的遺伝子の発現の有無が一致する発現するベクターを作成し対応する。
また，システム構築に関しては，細胞表面にある細胞質突起構造識別のアルゴリズム作成を目指し，作成後に結果を比較検討する。その上で，適宜データセットの追加や各パラメータの調整をおこなっていく。
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| Causes of Carryover |
当初の計画通り，機械学習を用いた構造判別評価システムの構築を進めており，細胞質突起の性状が異なる状態およびその遷移過程の評価をおこなうために用いる細胞の作製にも着手している。しかしながら研究を進めていく中で，システムを本稼働するためのメインPCの決定はアルゴリズム作成後に決定することでより適した仕様とできると考え，研究実施初年度においての購入を見送った。また，共同研究先へ3, 4ヶ月に1回ほどの頻度で訪問し，研究分担者と密に連携し本研究を進めることを計画していたが，コロナ禍の影響で往来ができず，旅費の費用が発生しなかった。これら２つが主な理由で，次年度使用額が生じた。
今後，本研究を進めていき，システムを本稼働するためのメインPCの最適な仕様が確定し次第，購入をおこなう。また，安定化細胞の樹立に関する取組みに挑むため，遺伝子ベクター作成，導入などにともなう新規の物品・消耗品の購入をおこなう。さらにコロナ禍が収束し，往来が従来通りになれば，研究分担者とより効率的に研究を進めることを計画している。
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Research Products
(2 results)
