A novel approach for analyzing the three-dimensional dynamics of cell motility by the combined use of scanning ion conductance microscopy and machine-learning

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07217
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 水谷 祐輔 北海道大学, 総合IR室, 准教授 (40646238)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三上 剛和 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80434075)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: イオンコンダクタンス顕微鏡 / 細胞質突起 / 機械学習 / 画像解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究は，走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）を用いて取得できる生きた細胞の頂上膜面の細胞質突起の画像からダイナミクスを解析し，そのダイナミクスと細胞機能の関係性を解明することを目的としている。そのダイナミクスの解析には，本研究を通して構築する機械学習を用いたコンピュータ支援構造判別評価システムを使用し，困難さを多く含む画像判別を自動化することでより効率的におこなう事を並行して実施するものである。
取り組んでいる課題を以下に示した。
1. 画像データセットの収集と機械学習用データを用いたシステムの構築：　申請者は現在までに各種実験を通して撮像したSICM像を所有し，継続的に画像データセットの収集および本研究に学習データとして用いるデータセットを選別しタグ付け作業をおこなった。また，システムの構築は，フリーウエアで構築を進め，テスト画像データ等を処理させるなど適したものの選定をおこない，機械学習の作業環境整備を進め，識別アルゴリズムの作成を進展させている。
2. 　各細胞の細胞質突起の構造観察：　SICMを用いた画像取得は，探針であるガラスピペットの形状や細胞の状態に依って適した画像取得に関するパラメータは異なる。本研究では，細胞質突起の観察における各種条件を精査することで，現状において適した画像取得パラメータを見出した。
3. 　可逆的形態変化のコントロール可能な細胞質突起構造をもつ細胞の探索：　Tet受容体恒常発現細胞（TetR-Ca9-22 cells) の樹立に成功したが，当初期待していた顕著な細胞形態の変化は認められなかった。そこで，RAW264細胞をマクロファージ様細胞に分化誘導する実験モデルを検討し，本研究に適すると考える可逆的形態変化のコントロール可能な突起構造を有する条件を新たに見出した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

機械学習を用いた構造判別評価システムの構築に関しては，学習データ用に準備したSICM像のデータセットにより機械学習を実行し，細胞表面にある細胞質突起構造識別のアルゴリズムの作成を進展させている。
また，細胞質突起の性状が異なる状態およびその遷移過程の評価をおこなうために用いる細胞の作製も進行させているが，研究計画とは異なり，予期していなかったことが起こっている。
Tet On/Offシステムを用いてSLPIの発現を制御可能なCa9-22細胞を樹立する目的で，前年度までに，Tet受容体恒常発現Ca9-22細胞（TetR-Ca9-22 cells) を樹立した。その後，TetR応答プロモーター制御下にSLPIを発現するベクターを作成し，これをTetR-Ca9-22 cells にトランスフェクションした。その結果，Tetの有無によってSLPI の発現を制御することのできる細胞を樹立することに成功した。しかし，この細胞では，当初期待していた顕著な細胞形態の変化は認められなかった。SLPI欠損による細胞形態変化が不可逆的効果であった場合には，SLPI発現の有無による細胞質突起変化の解析が困難になることから，代替となる様々な実験モデルの検討を行ってきた。
本年度は，その候補として，単球様のマウス由来RAW264をマクロファージ様細胞に分化誘導する実験モデルを検討した。その結果、球形のRAW264細胞をLPS（Lipopolysaccharide）や二本鎖 RNA のPoly(I:C)で刺激すると，数時間から24時間程度で，発達した細胞突起を有するマクロファージ様細胞に分化誘導することが可能であり，この実験モデルが本研究に適していることを見出すことができるようになった。
これらを総合して，計画全体としてはやや遅れての進捗となっている。

Strategy for Future Research Activity

今後の本研究課題を滞りなく進めていくためには，SLPIの発現の ON/OFFがおこなえるTet受容体を恒常的に発現するCa9-22細胞の作製を一旦中止し，代替として研究に適していると判断したマウスマクロファージ由来Raw264細胞を用いて研究を進展させていく。LPS（Lipopolysaccharide）や二本鎖 RNA のPoly(I:C)による分化誘導を進め，本研究課題に適した培養条件を見つけ，SICMによる画像取得を進める。
さらにシステム構築に関しては，細胞表面にある細胞質突起構造識別のアルゴリズム作成を目指し，現在までに収集していたCa9-22細胞の画像データを活用することが可能か模索をおこなう。その上で引き続き，適宜データセットの追加や各パラメータの調整をおこなう。また，SICMを用いた画像取得は，探針であるガラスピペットを用いており，その先端の状態によってS/N比が変化し，取得される画像に影響が出る。そのため取得された画像を適切に補正し効率良くデータセットとして使用可能となる様な機能をシステムに追加で取り入れることを検討する。

Causes of Carryover

主な理由は２つある。1つ目は，当初の計画通り，機械学習を用いた構造判別評価システムの構築を進めており，細胞質突起の性状が異なる状態およびその遷移過程の評価をおこなうために用いる細胞の作製も進行している。しかしながら研究を進めていく中で，システムを本稼働するためのメインPCの決定はアルゴリズム作成後に決定することでより適した仕様とできると考え，購入を見送ったものである。また2つ目は，共同研究先へ3, 4ヶ月に1回ほどの頻度で訪問し，研究分担者と密に連携し本研究を進めることを計画していたが，コロナ禍の影響で昨年同様に往来ができず，旅費の費用が発生しなかったことに依る。以上の理由で，次年度使用額が生じた。
今後，本研究を進めていき，システムを本稼働するためのメインPCの最適な仕様が確定し次第，購入をおこなう。また，マクロファージ由来細胞の分化誘導の最適化などにともなう新規の物品・消耗品の購入をおこなう。コロナ禍が収束し，往来が従来通りになれば研究分担者とより効率的に研究を進めることを計画している。

Research Products

• [Book] Scanning Ion Conductance Microscopy (Bioanalytical Reviews, 3) (2022)
  • Author(s): L. A. Baker, A. Bhargava, M.-H. Choi, I. D. Dietzel, A. Gesper, J. Gorelik, A. Haak, P. Happel, F. Iwata, Y. Korchev, C. W. Leasor , M. V. Makarova, Y. Mizutani, M. Nakajima, P. Novak, T. E. Schaeffer, A. Shevchuk, Y. Takahashi, T. Ushiki, H. von Eysmondt
  • Total Pages: 241
  • Publisher: Springer
  • ISBN: 978-3031144424