2020 Fiscal Year Research-status Report
神経形成におけるClk2キナーゼ経路の役割とその破綻による自閉症発症機構の解明
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20K07225
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
鈴木 厚 広島大学, 両生類研究センター, 准教授 (20314726)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹林 公子 (鈴木) 広島大学, 両生類研究センター, 研究員 (00397910)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 自閉症 / 神経形成 / 誘導因子シグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
自閉症は、社会性障害などを特徴とする発達障害群であり、脳の構造と機能の異常が基礎にあると考えられる。ヒトの遺伝学的解析や変異マウスの解析が始まっているが、その発症機序はよく分かっていない。研究代表者らは、神経発生学的解析に強みを持つツメガエルの神経板に局在するキナーゼとしてClk2を単離し、Clk2が神経形成に重要な誘導因子シグナルを制御して神経誘導を引き起こすことを2019年に論文発表した。最近、哺乳類のClk2が自閉症治療薬の創薬ターゲットになることが示され、Clk2キナーゼ経路の機能解析が早急に必要である。本研究では、Clk2キナーゼ経路の神経形成における役割を解析し、Clk2キナーゼ経路の破綻が脳形成異常を発症する機構を解明する。
今年度は、Clk2と協調して神経形成を制御する候補遺伝子をとしてClk1とClk3を同定した。時期特異的な発現パターンを調べたところ、Clk1とClk3は母性mRNAとして発現しており、神経胚期以降に発現レベルが急速に上昇することが分かった。ホールマウントin situハイブリダイゼーション法による解析では、Clk1とClk3が神経胚期から尾芽胚期にかけて脳・脊髄などの神経系に限局して強く発現することが分かった。さらに、Clk1とClk3をツメガエルの発生過程で過剰発現すると神経形成が促進されたことから、これらの遺伝子がClk2と協調して神経形成を制御する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Clk2のパラログとして脊椎動物ではClk1, Clk3, Clk4の存在が示唆されている。ツメガエルのゲノムデータベースおよび遺伝子発現データベースを検索した結果、Clk1とClk3がClk2と協調して神経形成を制御している可能性が考えられた。そこで、Clk1とClk3を検出することが可能なプライマーを設計し、各発生ステージ別に収集したツメガエル胚のcDNAを用いて時期特異的な発現パターンを調べたところ、Clk1とClk3は母性mRNAとして発現しており、神経胚期以降に発現レベルが急速に上昇することが分かった。次に、発現量が高い神経胚期のcDNAからPCR法によって完全長のClk1とClk3遺伝子を単離することに成功した。得られた完全長cDNAからアンチセンスプローブを作製した後、各発生ステージで固定したツメガエル胚を用いてホールマウントin situハイブリダイゼーション法を行った。その結果、Clk1とClk3は胞胚期まで外胚葉領域全域で弱く発現しており、原腸胚期において主に背側の予定神経外胚葉に発現した後、神経胚期から尾芽胚期にかけて脳・脊髄などの神経系に限局して強い発現が見られることが分かった。さらに、Clk1とClk3を原腸胚期以降に限定して過剰発現するために、グルココルチコイド受容体と融合させた誘導型コンストラクトを作製した。誘導型Clk1およびClk3をコードするmRNAをツメガエル胚に顕微注入して過剰発現した後に外胚葉組織片を取り出して培養すると、神経マーカー遺伝子の発現が誘導されていた。以上のことから、ツメガエルの初期発生過程においてClk1とClk3は神経領域に高いレベルで発現して、神経形成を促進する活性を持つことが示された。したがって、おおむね研究は順調に進んでいると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、Clk1, Clk2, Clk3のそれぞれに特異的なモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製し、これをツメガエル初期胚に顕微注入することによって機能阻害実験を行う。また、機能阻害胚の形態や遺伝子マーカーの発現を調べることによって、脳形成異常を発症する機構を分子レベルで解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
老朽化により買い替えを考えていたフリーザーの納品がコロナ禍により通常以上に時間がかかることから、購入を次年度に持ち越したため。予定通り、フリーザーの購入に充てる予定である。
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