Post-transcriptional control of spermatogonial stem cell self-renewal and differentiation

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07228
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 黒羽 一誠 横浜市立大学, 医学部, 助教 (50580015)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 精子幹細胞 / エピジェネティクス / 転写後制御

Outline of Annual Research Achievements

精子幹細胞が自己複製能を不可逆的に喪失し、精子形成へ向けて運命決定される一時期において、大規模なゲノム修飾が引き起こされる転換点が存在する。この大規模なゲノム修飾を起こすための鍵となる酵素(Dnmt3aとGLPタンパク質)の増加は、転写ではなく翻訳により制御されることが示唆されている。本研究は、この転換点における翻訳制御の実態を明らかにするため、1) mRNAの翻訳、2) タンパク質またはmRNAの分解、3) mRNAの修飾、の可能性について解析することにした。これにより、精子幹細胞の分化開始機構が明らかになるだけでなく、種の保存や、不妊症の原因解明とその治療への応用も期待される。
mRNAの翻訳に関わるmRNAの核外輸送について、in situ hybridization法による解析を行った。その結果、各酵素のmRNAは転換点の前後でいずれも細胞質に局在していたことから、mRNAの核外輸送がゲノム修飾酵素の発現増加に関わる可能性は極めて低いことが示唆された。
細胞の持つ翻訳活性を評価するため、ピューロマイシンアナログの取り込み量を指標として、全mRNAの翻訳量の変化を解析した。その結果、成熟過程にある精子幹細胞において、細胞の翻訳活性が顕著に増加する一時点を見出した。しかしながら、この一時点とゲノム修飾の転換点が明確に一致していなかったことから、ゲノム修飾酵素の発現上昇が、細胞分化の進行に伴う翻訳活性の上昇(=全mRNAの翻訳の亢進)に依存している可能性は低いと考えられた。したがって、ゲノム修飾酵素の発現は、各mRNAに対する選択的な機構により制御されていることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

1) マウス精巣から純化できる精子幹細胞数が予想より少ないこと、2) マウス精子幹細胞を試験管内で増幅する系 (Germline stem cell) の培養条件決定には長期的な培養が必要であることが明らかとなり、研究対象となる細胞の取得に当初の予想より苦労を要した。また、新たに立ち上げる実験について、3) 実験条件の検討に予想より多くの予備実験が必要となったことも重なり、実験計画に遅延が生じた。しかしその中で、転換点での翻訳制御に関わる、1) mRNAの核外輸送の変化、2) 細胞分化に伴う翻訳活性の上昇、に依存する可能性を除外することのできる結果が得られたことは、大きな前進であったと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

これまでの実験で条件を確立できたIn situ hybridization法を応用し、蛍光抗体を使用したマルチプレックス解析を行い、ゲノム修飾酵素のmRNAと細胞内構造体(P-bodyやストレス顆粒)との関連性を解析する予定である。 また、各mRNAの長さや修飾が、転換点の前後で変化していることを示唆する結果が得られていることから、これを別の実験(ロングリードシークエンスなど)で確認すると共に、各mRNAが選択的な機構によって発現制御を受けている可能性を中心に解析を進めていく予定である。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由: 実験の対象となる細胞の取得に苦労を要したことから、予想より研究計画に遅延が生じている。そのため、予定していた複数の実験に必要な消耗品をまだ購入できていない。
使用計画: 次年度支給額と繰越金を、進展のあった研究計画をさらに進めるために使用すると共に、まだ手がつけられていない研究に必要な消耗品を購入していく予定である。

Research Products

• [Journal Article] Tsga8 is required for spermatid morphogenesis and male fertility in mice (2021)
  • Author(s): Kobayashi Yuki、Tomizawa Shin-ichi、Ono Michio、Kuroha Kazushige、Minamizawa Keisuke、Natsume Koji、Dizdarevic Selma、Dockal Ivana、Tanaka Hiromitsu、Kawagoe Tatsukata、Seki Masahide、Suzuki Yutaka、Ogonuki Narumi、Inoue Kimiko、Matoba Shogo、Anastassiadis Konstantinos、Mizuki Nobuhisa、Ogura Atsuo、Ohbo Kazuyuki
  • Journal Title: Development Volume: 148 Pages: dev.196212
  • DOI: 10.1242/dev.196212
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research