2022 Fiscal Year Research-status Report
Morphological and molecular analysis of glial plasticity in development and senescence of cutaneous mechanoreceptors
| Project/Area Number |
20K07236
|
|---|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
岩永 ひろみ 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (30193759)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 細胞組織化学 / 皮膚感覚装置 / グリア可塑性 / 終末シュワン細胞， / プリン作動性信号 / 細胞動態 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ラット頬ひげ動き受容器槍型終末は，薄板突起で軸索を包む終末シュワン細胞とその予備軍とされる星形シュワン様細胞の2種グリアを随伴する。前年度までに分離標本を用い，両細胞種が軸索終末から放出される信号物質ATPの受容体P2Y2を発現すること，星形シュワン様細胞ではP2Y2作動薬が細胞内信号分子ERK1/2の活性化（リン酸化）を惹き起こすことを示した。また槍型終末が形態成熟する生後21日以降のラットで，頬ひげ毛包全周を俯瞰する丸ごと標本作成法を確立した。これを用い，本年度は動物の成長に伴う上記2種グリア細胞の動態とプリン作動性信号の働きをしらべるため，以下の実験１，２を行った。
実験１．グリアが緑色蛍光を発する遺伝子改変ラットを4匹ずつ以下のA－E群に分け，ホルマリン灌流固定組織から頬ひげ毛包丸ごと標本を作成，毛包全周に分布する問題の2種細胞を共焦点顕微鏡の立体再構築像で観察・計数した。A.正常群21日齢，B.同28日齢，C.媒体皮下投与群28日齢，D.P2Y2遮断剤皮下投与群28日齢，E.ERK阻害剤皮下投与群28日齢。
実験２．生後17-27日齢ラットにチミジン類似物質EdU 5 mg/kgを連日1回5日間腹腔内に投与し，投与最終日の翌日に材料採取して頬ひげ毛包丸ごと標本を作成，Click-iT Plus (Invitrogen) で分裂細胞を可視化した。
実験１では，生後21-28日の間に槍型終末への新規グリア動員を示唆して，毛包全周の終末シュワン細胞総数が初めの約10%増加し，ほぼ相当数の星形シュワン様細胞が減少していた。P2Y2遮断剤はこの細胞動員を有意に抑制し，ERK阻害剤も同様の効果を示した。実験２で，問題の2種グリア細胞にチミジン類似物質の取り込みは検出されず，観察された生後成長期間の槍型終末へのグリア動員は細胞分裂を伴わないことがわかった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和4年度は，生後21日齢以降成長期から成熟・老齢ラットの頬ひげ槍型終末を観察対象として，ホルマリン固定組織から槍型終末を含む毛包丸ごと標本を作成して共焦点顕微鏡で立体観察し，以下の（1），（２）を行うことを計画していた。
（１）毛包成長に伴う槍型感覚終末の構造改変を軸索終末のグリア鞘をなす終末シュワン細胞とその予備軍とされる星形シュワン様細胞の増減・分布変化として量的にとらえ，細胞のATP受容体P2Y2の遮断効果とその細胞内信号経路を生体レベルの実験で解析する。
（２）成熟期（2－6カ月齢）および老年期（1歳）のラットの槍型終末の形態変化とそれにまつわる上記2種グリア細胞の数・分布の変化を解析する。
上記（１）に関しては，星形シュワン様細胞が終末シュワン細胞に姿を変え形態成熟後の槍型終末グリア鞘に動員されること，この細胞動員は星形シュワン様細胞のP2Y2受容体を介した細胞内信号分子ERKのリン酸化に少なくとも部分的に依存していることを明らかにし，当初の計画通りに実験を進めることができた。これらの成果を2回の国内学会で報告し，また，一部は論文としてすでに発表した。上記（２）に関しては，有髄神経の再生でみられる修復シュワン細胞に似たグリア性細胞，軸索終末の退行変化を示唆する特異な構造とそれを囲い込むグリア突起などが新たに見出されたが，それらの存在意義，問題の2種グリア細胞との関係を解析するため，さらに光顕・電顕的精査が必要である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
形態成熟後の比較的若い槍型感覚終末でみられた，P2Y2受容体活性化依存的な星形シュワン様細胞のグリア鞘への動員に関しては，同受容体が脳グリア細胞を含むさまざまな細胞の炎症性変化に関わるとの近年の報告を注視する必要があり，この分野の研究者が集まる国際学会 第16回 European Meeting on Glial Cells in Health and Disease (正常及び病的グリア細胞に関する西欧会議，2023年7月8―11日，ベルリン)で成果を発表し，意見交換を行う予定であり，発表内容に関する論文を執筆中である。
成熟期および老年期の槍型終末でみられた特異な構造物とグリア性細胞との関係については，すでに採取・固定した組織材料で毛包丸ごと標本を作成し，グリアの貪食能指標であるガレクチン３免疫染色と組み合わせて共焦点顕微鏡解析を行うのに加え，細胞分裂・細胞死の組織化学的検出と電顕観察のため新たに標本を採取する予定である。
|
| Causes of Carryover |
末梢・中枢神経系のグリア研究をひろく扱う国際学会に参加し成果発表と情報収集を行うことを計画していたが，コロナ2019感染症拡大のため長く学会が通常開催されなかった。次年度は，その学会が問題感染症の鎮静化以来，初めて完全な形でベルリンで開催されるので，これに出席して発表・意見交換を行い，未使用額の一部はその学会旅費（30万円）にあてる予定である。
また，成熟期および老年期ラットへの細胞分裂検出用試薬（チミジン類似物質）（一式12万円）の長期投与実験のため，手技に通じた実験支援者を雇用する計画であったが，コロナ2019感染症拡大のため適切な支援者の雇用が難しく，予定していた回数の実験を行えなかった。こうした制限の中で，一貫性のある興味深い所見が得られたので，未使用額は，その所見を確認・精査する追加実験のための動物飼料，実験用試薬の購入にあてる予定である。
|
