2021 Fiscal Year Research-status Report
新しい遺伝子改変マウスを用いた脳神経小胞でのV-ATPaseの機能解析
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20K07243
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
青戸 一司 浜松医科大学, 医学部, 助教 (60360476)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 小児難治性てんかん原因遺伝子 / V-ATPase / ATP6VA1 / 小胞（リソソーム・シナプス小胞 / Atp6v0a1-A512Pマウス / TetON3G-Creマウス / Atp6v0a1-floxマウス / Atp6v0a1-3xHAマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最近、申請者らはてんかんの原因遺伝子としてATP6VA1の p.A512P変異を見出した。ATP6V0A1はプロトンポンプであるV-ATPaseの構成サブユニットの１つである。培養細胞の解析から、V-ATPaseは、小胞（リソソーム・シナプス小胞）で発現し、小胞内のpH調節、細胞死制御、オートファジー、mTorシグナル制御などに関与することが明らかになっているが、有用なマウスモデルがないため、脳神経でのV-ATPaseの機能は十分にわかっていない。本研究では、以下の3つの変異マウスを用いた解析によって、脳神経の小胞におけるV-ATPaseの生理的役割、及び、小胞の形成・維持に関与する分子群を明らかにする。A)変異ノックインマウス (Atp6v0a1A512P): 小児の難治性てんかん患者で同定された原因遺伝子変異（A512P）を導入したマウスの解析により、発生期の脳神経細胞のリソソームでのV-ATPaseの機能を明らかにする。B)薬剤投与で遺伝子欠損を誘導可能なマウス (TetONマウス：TetON3G-Cre; Atp6v0a1flox): 成獣において薬剤投与で遺伝子欠損させることで、成熟した脳神経細胞のシナプス小胞でのV-ATPaseの機能を明らかにする。C)Atp6v0a1のC末端に3xHAタグを挿入したマウス (Atp6v0a13xHA): HAタグに対する免疫沈降によってAtp6v0a1を発現する小胞を単離できる方法（Vesicle-IP法）でプロテオーム解析を行い、V-ATPaseを発現する小胞の形成・維持に関与する分子群を同定する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
てんかん性脳症の原因遺伝子として、細胞内小胞（小胞体、シナプス小胞、リソソーム）の膜に発現し、プロトンポンプであるV-ATPaseの構成サブユニットの１つであるATP6VA1のp.A512Pを含めた４変異を見出した。これらA512P変異マウス（Atp6v0a1A512P）、R741Q変異マウス（Atp6v0a1R741Q）及びノックアウトマウス（Atp6v0a1KO）を作製して解析を行い、リソソームなどの小胞内のpH調節の異常、細胞死制御、オートファジー、mTorシグナル制御などに関与することを明らかにし、本年度論文として発表した（Aoto, Nature communications, 2021年4月）。
i-GONAD法を用いたAtp6v0a1のコンディショナルノックアウトマウス（Atp6v0a1flox）の作製を完了していないが、Atp6v0a1のC末端に3xHAタグを挿入したマウス(Atp6v0a13xHA)は作製でき、ウェスタンブロットでAtp6v0a1-3xHAのタンパク質の発現を脳のサンプルで確認できた。TetON3G-Creマウスは、ターゲティングベクター作製が終了し、マイクロインジェクションでは作製が難しかったため、マウスES細胞に遺伝子ターゲティングを行い、アグリゲイジョンキメラ法でマウス個体とする予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Atp6v0a1のコンディショナルノックアウトマウス（Atp6v0a1flox）の作製は、片側5’floxは作製できているので、交配して、このホモ変異体をもとに3’floxを挿入して、両側のfloxマウスを作る。
作製を終えたAtp6v0a1のC末端に3xHAタグを挿入したマウス(Atp6v0a13xHA)を使って、個体から、あるいはマウスからmouse embryonic fibloblast (MEF)細胞から、小胞・リソソームのタンパクを単離同定する。これらのリストと、2021年度にゲノム支援を受けてバルクのRNA-seqを行ってもらったリストを比較することによって、小胞・リソソームに関連するシグナル分子経路を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
昨年度より本年度の使用予定額が上まわったのは、研究の予定に変更があったためである。昨年度は新規変異マウス作製方法i-GONAD法を用いたため、作製にかかる費用が抑えられたためである。本年度は、引き続き作製を行うのと、作製できたマウスの表現型解析のために、遺伝子判定試薬、抗体関連試薬、細胞培養関連試薬、イメージング試薬などを購入するために使用予定額が多くなる予定である。
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[Journal Article] ATP6V0A1 encoding the a1-subunit of the V0 domain of vacuolar H+-ATPases is essential for brain development in humans and mice2021
Author(s)
Aoto K, Kato M, Akita T, Nakashima M, Mutoh H, Akasaka N, Tohyama J, Nomura Y, Hoshino K, Ago Y, Tanaka R, Epstein O, Ben-Haim R, Heyman E, Miyazaki T, Belal H, Takabayashi S, Ohba C, Takata A, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 12
Pages: 2107
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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