2020 Fiscal Year Research-status Report
マウス脳発生期における海馬CA1錐体細胞の移動制御要因の解明
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20K07251
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
北澤 彩子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任助教 (10535298)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 海馬CA1錐体細胞 / 大脳新皮質錐体細胞 / 細胞移動 / 細胞移植 / 子宮内胎仔脳電気穿孔法 / ピューロマイシン / 放射状グリア線維 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス海馬CA1錐体細胞の移動様式であるクライミングモードの特徴を得るため、本年度は、形態および細胞密度などを、大脳新皮質錐体細胞の移動様式であるロコモーションと比較することを目的としていた。マウス胎仔に電気穿孔法を用いて蛍光タンパク質遺伝子を導入し観察を行った結果、CA1錐体細胞は多くの先導突起を同時に複数出し入れし複雑な形態で移動することを示し、電子顕微鏡による移動領域の観察では、CA1錐体細胞も大脳新皮質錐体細胞も同様に細胞―細胞接着、あるいは、細胞ー線維接着を持つことを示した。一方、大きな違いとして、CA1錐体細胞の移動領域が細胞や線維が多く存在し、大脳新皮質錐体細胞の移動領域とは密度が異なることを示した。
そこで、クライミングモードの特徴的な形態が物理的な環境の違いであるのかどうかを検討するため、大脳新皮質へのCA1錐体細胞の異所移植を行ったが、CA1錐体細胞はほとんど移動できず形態も複雑なままであったことから、単純な物理的要因ではないことを明らかにした。
次に、移動形態を特徴付ける要因が、周囲の細胞にあるのかあるいは移動細胞自身にあるのかどうかを検討するために、足場である放射状グリア線維との共培養を試みる予定であるが、現在までに放射状グリア線維を維持して培養する方法が確立されていなかった。我々は、電気穿孔法によりピューロマイシン耐性遺伝子を放射状グリア細胞に導入し、脳のスライス培養を行う際にピューロマイシンを添加することで、耐性遺伝子が導入された放射状グリア細胞のみを培養する方法を開発した。
以上の結果、本年度は、CA1錐体細胞の移動場所の物理的な環境が大脳新皮質とは異なることを明示したが、その複雑な動態制御には関係しないことを明らかにした。また、足場である放射状グリア線維を保った状態での新たな培養方法を開発する事にも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、クライミングモードの詳しい形態観察と足場である放射状グリア線維の新たな培養方法の確立、さらには異所移植を通したクライミングモードを特徴付ける要因の検討を計画していた。
顕微鏡観察及び電子顕微鏡観察においては、CA1錐体細胞が大変複雑に先導突起を出し入れしており、さらに細胞体や線維などが密に存在している中を他の組織と接着しながら移動するという形態、環境上の特徴を得ることができた。また、クライミングモードの特徴が物理的要因か、周囲の細胞にあるのかなどについて検討するために、CA1錐体細胞をより細胞が租に存在する大脳新皮質錐体細胞層へ異所的な移植を試みたが結果は移動できず、つまり、単純な物理的な要因ではないという事を明らかにした。
さらに、放射状グリア細胞の培養方法を確立するために、ピューロマイシン耐性遺伝子とピューロマイシンおよびスライス培養を用いることで、放射状線維を保持した状態で且つ、周囲の細胞を排除することができたことから新たな放射状グリア細胞の培養方法を確立できたと考えている。
一方、CA1領域の放射状グリア線維は、どのように張り巡らされているのかよくわかっていないため、CA1領域のスライス培養を行う際に放射状グリア線維が切断されてしまうことが多い。そこで、透明化処理を施し、2光子顕微鏡などを用いて全体像を取得する試みも同時進行させていたが、現在、2光子顕微鏡で撮影するための適切なサンプル調整を試行錯誤し、撮影できる状態にまで進んでいる。
以上の結果、本年度はおおむね順調に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
クライミングモードの特徴が単純な物理的因子ではないことを明らかにしたことから、次年度では、得られた放射状グリア線維のスライス培養方法を用いて、周囲の環境、あるいは移動細胞自身に原因があるのかどうか等を検討する。ここで、もし細胞自身の特徴であった場合、大脳新皮質錐体細胞とCA1錐体細胞のマイクロアレイを行い、発現遺伝子を比較し、接着因子に関係する遺伝子などを探す予定である。また、周囲の環境が要因であった場合、まずは質量分析などの技術を用いて発現タンパク質などの比較を行う予定である。
一方、2光子顕微鏡を用いたCA1領域の放射状グリア線維の再構築については、本年度で様々な失敗のノウハウを蓄積することができたので、次年度では全長を撮影し、イマリスなどの画像解析ソフトを用いて再構築する予定である。
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| Causes of Carryover |
（理由）本年度はCovid-19の影響下で、国内学会用の旅費や参加費が減ったため。また、2光子顕微鏡の使用料が発生しなかったため。
（使用計画）中央機器の使用頻度が昨年度に比較して増えると考えられるため、そちらに使用する予定である。
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