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2021 Fiscal Year Research-status Report

Regulatory mechanism of calcium signaling in endoplasmic reticulum by novel K+ pump

Research Project

Project/Area Number 20K07258
Research InstitutionUniversity of Toyama

Principal Investigator

藤井 拓人  富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (50567980)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
KeywordsK+ポンプ / P型ATPase / 小胞体 / Ca2+シグナリング
Outline of Annual Research Achievements

小胞体は、Ca2+の貯蔵庫であり、小胞体からのCa2+放出は生体活動・維持に重要な様々なシグナルを誘導する。小胞体からの Ca2+ 放出には、K+チャネル(TRIC)によるK+の小胞体内への取り込みが必須であることが報告され、小胞体膜を介したK+輸送の重要性が明らかとなった。しかし、小胞体-細胞質間のK+濃度勾配の回復や維持には、K+チャネルにより取り込まれたK+を再び細胞質へ放出する「K+汲み出しポンプ」が必要であると考えられるが、その分子実体は不明である。我々は、様々な細胞の小胞体に共通して発現する「ER-ATPase(論文発表前のため仮称)」がK+-ATPase(K+ポンプ)として機能することを見出し、K+汲み出しポンプの実体である可能性が示唆された。
本研究は、(1)ER-ATPaseの小胞体におけるK+汲み出し機構およびその制御メカニズム、(2)小胞体Ca2+シグナリングにおける生理的意義、(3)ER-ATPaseの機能破綻による病態発症機構の解明を目的とし、K+ポンプの関与する小胞体Ca2+シグナリング制御機構という新規概念の実証を目的とする。
前年度の研究において、小胞体膜においてK+-ATPaseとして小胞体から細胞質へのK+放出を担っていること、またその機能が小胞体のCa2+貯蔵レベルおよび放出能に関与している可能性が明らかとなった。本年度は、(1)ER-ATPaseの機能を阻害もしくは活性化する化合物の探索、(2)ER-ATPaseと分子会合もしくは機能連関する分子の探索および機能解析、(3)筋小胞体におけるER-ATPaseの発現および機能について検討を行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

HEK293細胞におけるER-ATPase発現系を用いて、ER-ATPaseのATPase活性に効果を示す薬物のスクリーニングを行ったところ、胃プロトンポンプ(H+,K+-ATPase)阻害剤がER-ATPase活性を有意に抑制することを見出した。そのIC50値はH+,K+-ATPaseに対するIC50値と近似していた。H+,K+-ATPaseのK+結合部位および阻害剤の結合部位から推測された点変異体を種々作製しER-ATPase活性に対する影響を検討することでER-ATPaseのK+結合部位および胃プロトンポンプ阻害剤結合部位を明らかにした。また、プロテオーム解析よりER-ATPaseと機能連関する分子として、ミトコンドリア外膜タンパク質を見出した。現在両者の機能的関連性について詳細な検討を行っている。さらに、ウサギ骨格筋から調製した筋小胞体において、ER-ATPaseが発現していること、プロトンポンプ阻害剤で抑制されるER-ATPase活性の特性と類似したATPase活性が存在することを見出した。本年度の研究より、ER-ATPaseの阻害剤および関連分子の同定に成功したことから、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

下記の研究を行い、ER-ATPaseの小胞体における生理機能およびその発現および機能破綻が引き起こす病態生理機能の全容解明を目指す。(1)ER-ATPaseとミトコンドリア外膜タンパク質との機能連関の解明:ER-ATPaseとミトコンドリア外膜タンパク質の共発現系およびノックダウン(アウト)系を作製し、両者の分子会合、機能的関連性、機能連関が小胞体やミトコンドリアの局在や機能に与える影響について詳細に検討する。(2) ER-ATPaseノックアウト細胞もしくはマウスを作製し、フェノタイプ解析を行う。特に、小胞体の形態や機能異常および小胞体ストレスとの関連性に着目する。また、Ca2+シグナル関連タンパク質やミトコンドリア外膜タンパク質の発現や機能の変化について解析する。(4) ER-ATPaseの機能異常とヒトにおける病態との関連性の解明:上記研究において関連が示唆された疾患を罹患している患者の組織や細胞の単離、および初代培養細胞の作製を行い、ER-ATPaseの発現や機能の異常を検討する。また、がんを含めた関連疾患のヒト組織アレイを用いて、多検体の各種疾患患者の正常および病態組織におけるER-ATPaseの発現レベルおよび局在を検討し臨床データとの相関を検証する。

Causes of Carryover

少額の次年度使用額が生じたが、次年度に使用し、今後も当初計画通り研究
を進める。

  • Research Products

    (11 results)

All 2022 2021 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (8 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Regulation of TRPV1 channel activities by intracellular ATP in the absence of capsaicin2022

    • Author(s)
      Shimizu Takahiro、Yanase Nobuhiro、Fujii Takuto、Sakakibara Haruka、Sakai Hideki
    • Journal Title

      Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes

      Volume: 1864 Pages: 183782~183782

    • DOI

      10.1016/j.bbamem.2021.183782

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Inhibition of gastric H+,K+-ATPase by new dihydropyrazole derivative KYY-0082021

    • Author(s)
      Fujii Takuto、Sugimoto Kenji、Noda Takafumi、Shimizu Takahiro、Matsuya Yuji、Sakai Hideki
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 567 Pages: 177~182

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2021.06.056

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 小胞局在ナトリウムポンプを標的としたがん細胞グルコース輸送体の動態制御機構2022

    • Author(s)
      藤井拓人, 加藤瑞希, 清水貴浩, 田渕圭章, 清水康晴, 竹島 浩, 酒井秀紀
    • Organizer
      生理研研究会 「細胞の局所コミュニティ研究会」
  • [Presentation] Localization and function of Na+,K+-ATPase α3-isoform in the attached and detached cancer cells2022

    • Author(s)
      Takuto Fujii, Mizuki Katoh, Takahiro Shimizu, Shushi Nagamori, Keiichi Koizumi, Junya Fukuoka, Yoshiaki Tabuchi, Akira Sawaguchi, Tomoyuki Okumura, Kazuto Shibuya, Tsutomu Fujii, Hiroshi Takeshima, Hideki Sakai
    • Organizer
      第95回 日本薬理学会大会
  • [Presentation] Inhibition of translocation of intracellular Na+,K+-ATPase α3-isoform by cardiac glycosides in cancer cells2022

    • Author(s)
      Takuto Fujii, Mizuki Katoh, Takahiro Shimizu, Shushi Nagamori, Keiichi Koizumi, Junya Fukuoka, Yoshiaki Tabuchi, Akira Sawaguchi, Tomoyuki Okumura, Kazuto Shibuya, Tsutomu Fujii, Hiroshi Takeshima, Hideki Sakai
    • Organizer
      第99回日本生理学会大会
  • [Presentation] ヒキガエル毒素由来強心配糖体のがん細胞Na+,K+-ATPaseに対する効果2022

    • Author(s)
      藤井拓人, Nguyen Thi Tu Oanh, 清水康晴, 清水貴浩, 酒井秀紀
    • Organizer
      日本薬学会第142年会
  • [Presentation] 細胞内Na+,K+-ATPaseの動態変化が関与する剥離がん細胞の細胞死回避メカニズム.2021

    • Author(s)
      藤井拓人, 清水貴浩, 加藤瑞希, 永森收志, 小泉桂一, 奥村知之, 藤井努, 竹島浩, 酒井秀紀.
    • Organizer
      生理研研究会「上皮膜輸送の多様性・調和機構を基盤とする異分野融合研究の創出」
  • [Presentation] がん細胞内小胞のNa+,K+-ATPase α3-isoformの局在変化が関与するアノイキス回避機構.2021

    • Author(s)
      藤井拓人, 清水貴浩, 加藤瑞希, 永森收志, 小泉桂一, 奥村和之, 藤井努, 竹島浩, 酒井秀紀.
    • Organizer
      第68回中部日本生理学会
  • [Presentation] 細胞内Na+,K+-ATPaseの原形質膜移行が関与するがん細胞アノイキス耐性機構.2021

    • Author(s)
      藤井拓人, 清水貴浩, 加藤瑞希, 永森收志, 小泉桂一, 奥村和之, 藤井努, 竹島浩, 酒井秀紀.
    • Organizer
      第42回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • [Presentation] 小胞体に発現する新規K+ポンプの生理機能解明.2021

    • Author(s)
      三浦基, 藤井拓人, 清水貴浩, 田渕圭章, 酒井秀紀.
    • Organizer
      日本薬学会北陸支部第133回例会
  • [Remarks] 富山大学薬学部 薬物生理学研究室 ホームページ

    • URL

      http://www.pha.u-toyama.ac.jp/phaphy1/index-j.html

URL: 

Published: 2022-12-28  

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