膜電位による細胞機能制御メカニズムの解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07268
• Research Institution: Osaka Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 佐々木 真理 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (80435817)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 膜電位 / ERK / イメージング

Outline of Annual Research Achievements

膜電位とは細胞内外のイオン組成の違いに基づく、細胞内外間での電位差のことであり、神経細胞に限らず、すべての細胞が有している。本研究では、この膜電位が、細胞内分子シグナルをどのように制御しているかイメージング技術を駆使して明らかにすることを目的としている。
まず、細胞内シグナルの中でもERK活性に着目し、イメージングによりERK活性を測定する系を構築した。膜電位は、細胞外液のカリウム濃度を変化させることにより、人為的に操作できる。この系を用いて膜電位を変化させたときの、細胞内ERK活性をイメージングにより、測定したところ、膜電位の変動によって、ERK活性も変動することが明らかとなった。
今年度は、使用していた細胞の性質がかわってしまうなどし、再現性に問題がでたため、新たに、別の細胞を用いて再現性の確認を行った。膜電位を厳密な意味で変化させる方法として、今年度は、電気生理学的手法を用いた実験も行い、再現性を確認した。
また、膜電位変化にともなうERK活性変化のメカニズムの検討を生化学的に行い、脱分極によって、 いくつかのMAPカイネースカスケードが活性化していることが分かった。
個体レベルでの検証を行うために、蛍光膜電位プローブ、ERKの蛍光プローブを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインを樹立した。しかしながら、現在ある顕微鏡では、この魚の蛍光観察はできないことが明らかとなったため、現在新たな顕微鏡導入の検討を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

細胞の調子が悪くなり、実験が滞った時期があったが、新たな細胞株を細胞バンクから購入し、おおむね解決した。ゼブラフィッシュを用いた実験も計画していたが、現在ある顕微鏡システムでは、蛍光観察が難しいことが分かったため、細胞レベルでの実験に注力することとした。電気生理をイメージングを組み合わせた実験については、最低限のデータがとれたところで、顕微鏡が使えなくなってしまったので（修理不能）、今後別のセットアップを構築する必要に迫られているが、これについては、次年度中に開始できるめどはついている。

Strategy for Future Research Activity

ゼブラフィッシュを用いたイメージングについては、蛍光観察が難しそうであるが、光遺伝学を用いた実験については、改良の余地があるので、実験系の構築を行う。また、電気生理とイメージングを組み合わせた実験については、新たな実験系を構築する予定である。

Causes of Carryover

購入予定であった電気生理の機器を、研究室内で融通できる可能性が浮上したとともに、現在所有している顕微鏡の部品購入の必要性が秋ごろ明らかとなったために、予算を持ち越し、最善の決定をできるようにした。結果として、新たな実験に必要な部品の購入にあてることができるようになった。