2021 Fiscal Year Research-status Report
Mechanisms for extracellular electrolyte-dependent regulation of ion channel expression
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20K07277
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
小野 克重 大分大学, 医学部, 教授 (40253778)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | K+チャネル / 電解質 - 転写連関 / Kbp |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イオンチャネルは細胞内外のイオン濃度差を関知し細胞膜を横切るイオン流を制御して細胞の恒常性を維持する。その一方、イオン濃度勾配がイオンチャネルの数を変化させるような仕組みは存在しない。しかしながら、ヒト心房筋に発現する遺伝子を検索する過程で、高カリウム血症患者の心房筋の遺伝子発現プロフィールが正常カリウム濃度群患者のそれと異なることを見いだした。この現象は、イオンチャネルは単にゲーティングを介して細胞内外のイオン環境を保つだけでなく、チャネルの数そのものを変化させ、環境の変化に対応している可能性が示唆される。本背景に基づき、ラット心室筋を単離し培養する際に培養液のカリウム(K+)濃度を変化させて24時間後にKCNJ2 (Kir2.1)チャネルのmRNAの発現を評価すると、KCNJ2遺伝子が(mRNA)が有意に増加することを見いだした。すなわち、細胞外K+濃度が高いほど、KCNJ2チャネルの発現が増え、その結果、外向き電流の大きさが変化する可能性がある。細胞外K+濃度を上昇させるとIK1チャネルのコンダクタンスが増し、外向き電流は増大することが知られているが、イオンチャネルの発現そのものが変化することを示している。この結果は単にKCNJ2チャネルmRNAの変化だけを観察したものであるが、更に検討を進め細胞外K+の増加がKCNJ2チャネル蛋白質を増やすか否かを予備的に検討した結果を示していきたい。更にチャネル蛋白の変化をwestern blotで確認して定量化したものを示すことで細胞外K+が何らかの機序でKCNJ2蛋白を増加させる働きがあることを証明したい。K+結合蛋白(Kbp, YgaU他)の関与に注目し、KCNJ2チャネルの転写過程が細胞外K+によって制御されると考えら、細胞機能制御現象としての「電解質 - 転写連関」の概念を確立したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の実験成果によると、細胞外K+はイオンチャネルの発現そのものを制御し、細胞の長期環境順化の１つの対応機序として作用する可能性が示唆されている。このような細胞適応の概念はこれまで報告されたことがない。新規のイオン制御機構としてのこの機序の解明を目指し、以下の成果を得ている。細胞外K+がK+チャネル発現を制御する可能性が示された。細胞内カルシウムイオン(Ca2+)はセカンド・メッセンジャーとしてシグナル伝達に深く関わるが、その他の電解質、例えば生体に多く存在するナトリウム(Na+)やマグネシウム(Mg2+)という陽イオンが長期的にイオンチャネルの発現を制御する可能性があると我々は考えている。よって、細胞外K+がK+チャネル（これまでの成果ではKir2.1チャネル）の発現を正に調節するとう現象を手がかりに、細胞内外のイオンがイオンチャネルの発現、特に転写過程を制御するという、「電解質が電解質制御に直接関与する」という新規概念の確立を本研究は目指し、K+と類似構造をもつIa族元素である、ルビジウム(Rb)やセシウム(Cs)を比較群としてカリウムチャネル遺伝子(mRNA)及びタンパクの定量を行いつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞外環境を、高Na+、高Ｋ+、高Mg2+、 高Cl-環境としてラット心筋細胞を培養してDNA Arrayを用いて網羅的に全遺伝子の発現動向を解析する。In Silico 解析によって目的チャネルの転写に関わる可能性のある転写因子と転写補助因子を同定し、luciferase assayで作用を確認する。確定転写因子を心筋細胞（ラット、ヒト心房筋）とHEK 293細胞に導入し、心筋細胞と異種発現系の両方で目的イオンチャネル、転写因子、及びカリウム結合蛋白(Kbp, YgaU他)の発現が変化するかを電解質異常細胞培養液の元で確認し、機能異常をパッチクランプ法他で確認する。高K+血症モデルラット(5/6腎摘ラット)、及び高Mg2+血症ラット(浸透圧ポンプ法)、低Mg2+血症ラット（無Mg2+食）の心筋の網羅的遺伝子解析(DNA Array)とwestern blotによるIn Vitro実験の確認(2022年)。In Vivo実験の一部は予備実験により確認が進行している。K+結合蛋白(Kbp, YgaU他)の発現変化が認められれば、Kbpヘテロ欠乏マウスを作成し(外注)、チャネル失調を確認する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍で海外出張が中止となり、旅費に大きな余剰ができたため、同目的予算を消耗品として本年度に使用予定である。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Nitric oxide down-regulates voltage-gated Na+ channel in cardiomyocytes possibly through S-nitrosylation-mediated signaling2021
Author(s)
Wang P, Wei M, Zhu X, Liu Y, Yoshimura K, Zheng M, Liu G, Kume S, Morishima M, Kurokawa T, Ono K
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 11
Pages: 11273
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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