2021 Fiscal Year Research-status Report
心不全病態におけるmRNA脱アデニル化因子CNOT6Lの抗線維化作用の解明
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20K07285
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
山口 智和 秋田大学, 医学系研究科, 助教 (30749940)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | CCR4-NOT複合体 / 心臓リモデリング / 心筋線維芽細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心不全病態におけるmRNA脱アデニル化因子CNOT6Lの生理機能を明らかにするため、令和3年度は下記の項目について検討した。
1)CNOT6Lによる線維化遺伝子GeneX mRNAの脱アデニル化制御：これまでにCNOT6LがTAC圧負荷刺激後の心臓においてGeneX ｍRNA発現を抑制し線維化を抑制することを明らかにしてきた。RNA免疫沈降によりCNOT6L蛋白とGeneX mRNAの結合を確認した。PATアッセイによりmRNAのポリ(A) 鎖長を解析したところ、TAC後及びアンジオテンシンII(AngII)投与後のCNOT6L欠損心臓において、GeneX mRNAのpoly(A)鎖伸長を認めた。さらに、GeneXの3’UTR配列をルシフェラーゼ遺伝子に融合したレポータープラスミドを構築し解析を行ったところCNOT6Lの強制発現によりレポーター活性が減衰した。したがって、GeneXはCNOT6Lの脱アデニル化によって制御されることがわかった。
2)心臓線維芽細胞におけるGeneXの発現制御：CNOT6Lの標的細胞を明らかにするためにマウス新生仔の心臓より心筋細胞や線維芽細胞を単離してAngII刺激を行ったもののいずれもGeneXの発現誘導を認めなかった。そこで成体マウス心臓から心筋細胞及び線維芽細胞をコラゲナーゼ還流により単離しAngII刺激を行ったところ、線維芽細胞においてGeneXタンパク質の発現が誘導され、CNOT6Lの欠損により野生型と比較して有意に上昇した。同様にCNOT6L siRNAによるノックダウンでもGeneXの発現上昇が確認できた。以上の結果から、心臓リモデリングではCNOT6Lの標的細胞は心臓線維芽細胞であることが分かった。また、Gene Xの発現誘導とその制御機構は新生仔よりも成体の心臓線維芽細胞に特異的であり病態生理で重要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
圧負荷心不全病態におけるCNOT6Lの生理機能として、CNOT6Lが心臓線維芽細胞においてCCR4-NOT複合体の実行因子としてGeneX mRNA発現を負に制御し、心筋線維化の抑制に重要な役割を担うことが明らかになりつつある。これまでは遺伝子欠損マウスを用いた生体組織における解析が中心であったが、成体心臓からの心筋細胞及び線維芽細胞の単離法を確立できたため、これまで困難であったmRNA半減期測定をはじめとするin vitro解析が可能となり、GeneX mRNAの脱アデニル化制御の詳細を解析できると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
CNOT6LによるGeneXのmRNA制御機構の詳細を明らかにすることを主軸に研究を進める。CNOT6Lの欠損は圧負荷刺激後の心臓組織においてポリ(A) 鎖長の伸長を伴ったGeneX mRNAの発現増加を引き起こし、心臓線維芽細胞においてはGeneXタンパク質の増加を引き起こすことから、リモデリング下の心臓ではCNOT6Lが脱アデニル化を介して線維芽細胞におけるGeneX mRNA発現を負に制御することで線維化を抑制していることが考えられる。脱アデニル化によるGeneX mRNA制御の詳細を明らかにするため、Actinomycin D chase法により単離線維芽細胞におけるmRNA半減期の解析を行う。さらに、GeneXの3’UTR配列のルシフェラーゼアッセイからCNOT6Lによる脱アデニル化には3’UTR領域が重要であることが分かったので、3’UTR領域内にCNOT6Lと相互作用するRNA結合タンパク質(RBP)やmiRNAの結合モチーフが存在することが考えられる。配列解析から予想されるGeneX mRNA 3’UTRへの結合因子とCNOT6との相互作用の詳細を3’UTRレポーターへの変異導入や当該因子欠損下におけるCNOT6L のRNA免疫沈降により明らかにしていく。さらに、本学循環器内科との共同研究により、心不全患者の血液あるいは手術時の心筋生検サンプルを用いて、RT-PCR法、ウエスタンブロット法、あるいは免疫染色でCNOT6L、GeneXの遺伝子発現を解析し、ヒト心不全病態重症度との相関や、新規心不全バイオマーカーあるいは予後規定因子としての意義を見出す。
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[Journal Article] ACE2-like carboxypeptidase B38-CAP protects from SARS-CoV-2-induced lung injury2021
Author(s)
Yamaguchi T, Hoshizaki M, Minato T, Nirasawa S, Asaka MN, Niiyama M, Imai M, Uda A, Chan JF, Takahashi S, An J, Saku A, Nukiwa R, Utsumi D, Kiso M, Yasuhara A, Poon VK, Chan CC, Fujino Y, Motoyama S, Nagata S, Penninger JM, Kamada H, Yuen KY, Kamitani W, Maeda K, Kawaoka Y, Yasutomi Y, Imai Y, Kuba K.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 12
Pages: 6791
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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