2020 Fiscal Year Research-status Report
シナプス小胞の開口放出過程におけるシンタキシンの時空間ダイナミクス解析
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20K07286
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
並木 繁行 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (90452193)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | シンタキシン / １分子蛍光イメージング / シナプス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜上のシンタキシンを長時間に渡り一分子蛍光イメージングでトラッキングする系を確立する。そのために、研究代表者らが開発した連続的かつ持続的な蛍光標識を可能にするDeQODEタグ技術を採用する。DeQODEタグ技術では、細胞内に可視化対象の分子との融合タンパク質として発現させた抗消光団一本鎖抗体(DeQODEタグ)に、消光団であるジニトロフェニル基（DNP）と 蛍光物質を共有結合させた化合物（QODEプローブ）が結合した際にQODEプローブの蛍光消光が解除され、初めて蛍光性となる。蛍光性となった蛍光物質は励起光により数秒後に退色するが、退色したQODEプローブがDeQODEタグから解離し、退色していないQODEプローブがDeQODEタグに再度結合するサイクルを維持することで常に観察視野内に蛍光輝点が存在する状態になり、長時間に渡るの一分子蛍光イメージングが可能になる。全反射顕微鏡システムを用いてDeQODEタグとシンタキシンの融合タンパク質を発現させたCOS７細胞で一分子トラッキングをテストした。細胞外にQODEプローブとして蛍光色素のシリコンローダミンにDNPを結合させた6SiR-DNPを添加し、シンタキシンが蛍光標識され、蛍光輝点として観察できることが確認できた。また、一分子トラッキングに適した輝点密度となるように細胞外の6SiR-DNP濃度を調整することによって、バックグランド蛍光に対して6SiR-DNPの蛍光輝点像が十分なコントラストとなる励起光の強度、EM-CCDカメラの撮影条件を最適化できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画していた研究内容を滞りなく遂行することができた
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度に構築した長時間１分子蛍光イメージング系を培養神経細胞に適用して、シナプス機能とシンタキシンのシナプスでの時空間ダイナミクスとの関係の解明を進める。
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| Causes of Carryover |
一分子イメージング条件の最適化が順調に進んだため、当初計画より消耗品費の執行が少なかった。次年度に繰り越した額は神経細胞での一分子蛍光イメージングの条件の最適化を充実させるために光学部品などの消耗品費に充当する。
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[Journal Article] Real-time in vivo imaging of extracellular ATP in the brain with a hybrid-type fluorescent sensor2020
Author(s)
Kitajima N, Takikawa K, Sekiya H, Satoh K, Asanuma D, Sakamoto H, Takahashi S, Hanaoka K, Urano Y, Namiki S, Iino M, Hirose K
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Journal Title
eLife
Volume: 9
Pages: e57544
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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