2020 Fiscal Year Research-status Report

Development of novel therapeutic strategies for cartilage defects based on molecular mechanisms of hyaline cartilage regeneration promoted by chondrocyte sheets.

Research Project

Project/Area Number	20K07297
Research Institution	Tokai University
Principal Investigator	豊田恵利子東海大学, 医学部, 特定研究員 (90749269)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	佐藤正人東海大学, 医学部, 教授 (10056335)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	細胞シート / 軟骨再生 / 硝子軟骨 / 軟骨分化
Outline of Annual Research Achievements	軟骨は無血管組織であり、一度損傷を受けると通常では自然修復しないが、軟骨細胞シートを軟骨損傷部へ移植することにより、硝子軟骨の再生が促進されることが示されている。しかし、細胞シートの軟骨再生促進作用の詳細な機序は明らかとなっていない。軟骨細胞シートによる硝子軟骨の修復・再生には細胞シートが分泌する因子が寄与すると考えられることから、これまでに、軟骨細胞シートが産生する因子の網羅的な解析を実施し、硝子軟骨再生促進作用と産生量に相関がみられる液性因子の解析を行ってきた。本研究は、細胞シートの有効性相関因子の軟骨組織における機能を解析することにより、細胞シートの硝子軟骨再生促進作用に寄与する因子とその機能を明らかにし、細胞シートの作用機序を模した関節軟骨修復促進薬の開発につなげることを目的とする。本年度は、細胞シートの有効性相関因子として同定された複数の因子について、それぞれの産生量をELISAで解析した。さらに、様々な条件下で作製した細胞シートにおけるこれらの因子の遺伝子発現を解析した。また、in vitroでの軟骨分化誘導を行い、培養軟骨細胞が軟骨様組織を形成する際のこれらの因子の遺伝子発現を解析した。その結果、培養軟骨細胞の軟骨再分化時における発現の変動方向がそれぞれの因子で異なり、細胞シートの状態と関節内での軟骨再生時で産生量が変化することが示唆された。また、軟骨細胞のドナーにより変動方向が異なる因子があり、細胞シートの有効性の違いに関与する可能性が考えられた。今後、軟骨全層欠損モデルに対する細胞シート移植により再生した軟骨組織において、これらの因子の局在を解析し、有効性相関因子の過剰発現細胞シートの作製、関節内投与やノックアウトマウスの作製を実施する因子を決定する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本年度は、まず細胞シートの有効性相関因子として同定された複数の因子について、軟骨再生における寄与の有無を推定するため、因子量の測定を行った。ELISAによる細胞シートの上清確認では、それぞれの因子の産生量および有効性に影響を与える培養条件下での産生量の変動が確認できた。次に、生体内で再生した軟骨組織における発現を推測するため、in vitro軟骨分化誘導により多指症由来軟骨細胞から軟骨様組織を作製し、軟骨分化時の発現量の解析を計画したが、Ｒ２年度前半は長期培養が必要な分化誘導実験を実施することが難しく、実験の実施及び解析が遅れた。遺伝子発現解析の結果、有効性相関因子によって、軟骨分化に伴い増加するものと減少するものが存在したことから、減少するものについては生体内の軟骨再生への寄与は小さい可能性が示唆された。再生軟骨組織における各因子の免疫染色については、抗体の入荷に時間を要し、現在染色条件を検討中である。次年度は、遺伝子発現解析、再生軟骨組織の免疫染色および軟骨分化誘導系に対する因子の添加やノックダウンの結果を総合して、機能解析を進める因子を決定する予定である。
Strategy for Future Research Activity	有効性相関因子のうち硝子軟骨再生への寄与が大きいと推定される因子を絞り込むため、免疫染色を行い、再生軟骨組織における局在を解析する予定である。また、 in vitro軟骨分化誘導系における因子の添加およびノックダウンを行い、in vitro軟骨分化に対する影響を解析し、生体内における軟骨再生への寄与が大きいと推定される因子について、過剰発現ベクターの構築あるいは因子の関節内投与等、決定した因子に合わせた方法を選択し、生体内における機能解析を進める予定である。 in vitro軟骨分化誘導系に対するノックダウン条件の確立が課題である。
Causes of Carryover	本年度の結果に基づき重点的に解析を進める分子を決定し、過剰発現ベクターの外注や関節内投与試薬の購入を予定していたが、分子の絞り込みのためのデータ取得が遅れ、購入する試薬が決定しなかったため次年度使用とした。本年度解析する因子を決定後、ベクター構築や関節内投与用試薬の購入に使用して、研究を進める予定である。