2020 Fiscal Year Research-status Report
チャネルのイオン選択性異常を是正する作用薬の同定：遺伝性チャネル病の治療に向けて
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20K07304
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
陳 以珊 生理学研究所, 分子細胞生理研究領域, 特任助教 (40757770)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | イオン選択性 / イオンチャネル病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GIRK チャネルの遺伝子変異による異常なイオン選択性は、過剰な Na+ と Ca2+ の流入による細胞死を引き起こす。このような変異した GIRK チャネルによるイオン調節機能の障害は、Keppen-Lubinsky 症候群や原発性アルドステロン症等先天性疾患の原因である。
本研究の目的は、変異した GIRK チャネルの異常なイオン選択性を是正する新規メカニズムによる作用薬の探索である。我々は、既存の Weaver 変異マウスが有する GIRK2 G156S 変異体の in vitro 発現系での解析を重点的に行い、新規作用薬の同定、メカニズムの解明、さらにその薬による変異動物の細胞・組織・個体レベルの異常症状の改善の検証を目指す。
異常なイオン選択性を持つ GIRK2 の変異体を部位特異的変異導入法により作成し、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、二電極膜電位固定法により以下の電気生理学的解析を行った。その結果、T154del 変異体のイオン選択性は L173R 変異体のイオン選択性に類似しているが、G156S では異なるイオン選択性を示していることが明らかとなった。また、G156S 変異体では、ポアブロッカーの投与により K+ に比して Li+ と Na+ の電流相対量が増加したことが観察された。以上の結果から、G156S 変異体は、通常のイオン選択性フィルターの構成するイオン透過路とは異なるイオン選択性を持つ、第二のイオン透過路が新たに形成された可能性が示唆された。この研究結果を基に、今後は第二のイオン透過路の選択性阻害薬の同定を目指す実験を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
K+ チャネルの異常なイオン選択性の制御機構を解明するため、以下の実験を行った。
（1）GIRK2 チャネル変異体の特徴を同定するため、異常なイオン選択性を持つ GIRK2 の変異体を部位特異的変異導入法により作成し、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、二電極膜電位固定法により以下の電気生理学的解析を行った。その結果、野生型と比較して、T154del 変異体と L173R 変異体は特に Rb+ に対する透過性が高く、G156S 変異体の場合は Li+ と Na+ に対する透過性が高くなったことが観察された。以上の結果から、T154del 変異体のイオン選択性は L173R 変異体のイオン選択性に類似しているが、G156S では異なるイオン選択性を示していることが明らかとなった。
（2）GIRK2 チャネルのポアブロッカーである Ba2+ 又はペプチド毒素 TPN-Q の投与によるイオン選択性の変化の解析を行った。その結果、T154del と L173R 変異体は、ポアブロッカーの投与により K+ に比してのほかのイオンの電流相対量が変化しないことが明らかとなった。しかし、G156S 変異体では、ポアブロッカーの投与により K+ に比して Li+ とNa+ の電流相対量が増加したことが観察された。以上の結果から、G156S の変異により、ポアブロッカーの阻害するイオン選択性フィルターの構築するイオン透過路と異なる、Li+ とNa+ に対する選択性の高い第二のイオン透過路が新たに形成された可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究結果から、GIRK2 チャネルの G156S 変異体の異常なイオン選択性の機構について、従来と全く異なる解釈である「新規イオン透過路の形成による異常のイオン選択性の発生」の新規制御機構の可能性が示唆された。この結果を基に、今後は以下の実験を行う予定である。
（1）G156S 変異体のイオン透過路の開閉および構造基盤の理解を目的とした single-channel recordings
（2）G156S 第二のイオン透過路の選択性阻害薬の同定を目的とした小分子ライブラリーのスクリーニング
（3）FRET 計測法による選択性阻害薬の結合によるイオン選択性フィルターおよびその近辺構造変化の動態解析
（4）G156S 変異体のモデル動物 Weaver マウスを用いて選択性阻害薬による細胞・組織・個体レベルの治療効果の検証
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| Causes of Carryover |
2020年度は、GIRK チャネルの遺伝子変異による異常なイオン選択性の機構の解明について、主に電気生理学的解析を中心に行った。その結果、イオン選択性に関する新規制御機構の可能性を見出した。2021年度は、元2020年度購入予定である、FRET 計測に対応するため、蛍光 ミラーユニット、ダイクロイックブロックとフィルタブロック、光電子増倍管モジュールとその電源ユニット、および蛍光試薬と消耗品を購入し、新規作用薬の同定に関する光学的解析および電気生理学的解析を行う。また、野生型マウスと Weaver マウスおよび細胞培養用培地と消耗品を購入、新規作用薬の効果に関する動物実験を行う。
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