インスリン様成長因子等による側鎖型オキシステロール産生調節を介した新規情報伝達

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07314
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 杉本 博之 獨協医科大学, 医学部, 教授 (00235897)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安戸 博美 獨協医科大学, 医学部, 助教 (10704885)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: Cyp46A1 / Fetuin-B / Neuroblastoma / IGF-II

Outline of Annual Research Achievements

細胞はコレステロールをCyp46A1 により24-ヒドロキシコレステロール(オキシステロール)として細胞外に排出する。NIH3T3細胞のCyp46A1 mRNA量はFBS添加により抑制される。そこでNIH3T3細胞を用いてFBS中に存在するCyp46A1 mRNA量を抑制する因子の同定を行った。FBS をクロメタ抽出し脂質相と水相に分け効果をみたところ水相に転写抑制因子が存在することを突き止めた。FBSの水相由来の画分をHPLCで分画しCyp46A1 mRNAを低下させる分画を部分精製し質量分析装置で解析した。その結果抑制因子はIGF-IIであることが明らかとなった。同じ方法でヒト由来Neuroblastoma細胞(T98G細胞)を用いてIGF-IIのCyp46A1 mRNAへの影響をみたところNIH3T3細胞と異なり抑制効果はなかった。そこでT98G細胞を48時間スターブ状態で培養しFBSを添加したところCyp46A1 mRNA量は顕著に抑制されたことから、T98G細胞においてFBS中にはCyp46A1 mRNAを低下させるIGF-IIとは別の因子が存在すると考えた。T98G細胞を用いてFBS をクロメタ抽出し脂質相と水相に分け効果をみたところ水相に転写抑制因子が存在することを突き止めた。FBSの水相由来の画分をHPLCで分画しCyp46A1 mRNAを低下させる分画を部分精製し質量分析装置で解析したところ、Fetuin-Bが候補となった。市販の大腸菌高発現Fetuin-Bでも血液からの精製Fetuin-BでもCyp46A1 mRNA量抑制作用が認められた。現在、T98G細胞にFetuin-Bを添加し、Cyp46A1のwestern blotや質量分析装置を用いた各種オキシステロールの細胞内濃度変化を解析し、細胞レベルでのFetuin-Bの作用を解析中である。マウスにFetuin-B高発現プラスミドを静注しin vivoレベルでのFetuin-Bの作用を解析中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

NIH3T3細胞を用いてFBS中に存在するCyp46A1 mRNA量を抑制する因子の同定を行った。FBS をクロメタ抽出し脂質相と水相に分け効果をみたところ水相に転写抑制因子が存在することを突き止めた。FBSの水相由来の画分をHPLCで分画しCyp46A1 mRNAを低下させる分画を部分精製し質量分析装置で解析した。その結果抑制因子はIGF-IIであることが明らかとなった。同じ方法でヒト由来Neuroblastoma細胞(T98G細胞)を用いてIGF-IIのCyp46A1 mRNAへの影響をみたところNIH3T3細胞と異なり抑制効果はなかった。そこでT98G細胞を48時間スターブ状態で培養しFBSを添加したところCyp46A1 mRNA量は顕著に抑制されたことから、T98G細胞においてFBS中にはCyp46A1 mRNAを低下させるIGF-IIとは別の因子が存在すると考えた。T98G細胞を用いてFBS をクロメタ抽出し脂質相と水相に分け効果をみたところ水相に転写抑制因子が存在することを突き止めた。FBSの水相由来の画分をHPLCで分画しCyp46A1 mRNAを低下させる分画を部分精製し質量分析装置で解析したところ、Fetuin-Bが候補となった。市販の大腸菌高発現Fetuin-Bでも血液からの精製Fetuin-BでもCyp46A1 mRNA量抑制作用が認められた。また、Fetuin-B高発現プラスミドをマウスに投与し、Fetuin-Bの効果をin vivoで解析している。

Strategy for Future Research Activity

T98G細胞にFetuin-Bを添加し、Cyp46A1のwestern blotや質量分析装置を用いた各種オキシステロールの細胞内濃度変化を解析する。他のNeuroblastoma細胞を用いてT98G細胞と同じ効果があるか否か解析する。Fetuin-B高発現プラスミドをマウスに投与し、Fetuin-Bが高発現しているマウスの作成に成功した。このマウスを用いてin vivoでのFetuin-Bの作用を解析する。

Causes of Carryover

Fetuin-Bを高発現させたマウスを用いたin vivo実験が終了していないため。Fetuin-Bを細胞に添加しCyp46A1のWB解析や細胞内オキシステロール分子種の変化を解析するため。これらの実験を進めるためにはマウスの購入や飼育料、質量分析装置を稼働させるための消耗品が必要である。