2021 Fiscal Year Research-status Report

コレステロール誘導体による生体内脂質の新規合成制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	20K07329
Research Institution	Dokkyo Medical University
Principal Investigator	安戸博美獨協医科大学, 医学部, 助教 (10704885)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	リン脂質 / コレステロール / 細胞膜 / ヒストンアセチル化 / p300 / NF-Y
Outline of Annual Research Achievements	我々は、細胞膜を構成する主要な脂質であるがいまだ合成制御機構の解析が不十分であるホスファチジルエタノールアミン(PE)と、コレステロールの合成制御機構に注目し解析を進めてきた。その結果、それら脂質の合成がコレステロール誘導体(オキシステロール)により同様の機構で制御される事を明らかにしてきた。オキシステロールは転写因子NF-Yによるヒストンアセチル化を抑制し、PE合成の律速酵素ETおよびコレステロール合成の律速酵素Hmgcrの転写を負に制御することが明らかになった。その制御機構の詳細を分子基盤から明らかにする。 1.ETおよびHmgcrのオキシステロールによる転写抑制機構の解明転写促進因子NF-YはETやHmgcrのプロモーターに結合し、ヒストンアセチル化酵素p300をリクルートする。p300はヒストンをアセチル化し転写を正に制御する。代表的なオキシステロールである25-HCはこのp300のリクルート、ヒストンアセチル化を阻害し転写を抑制する。我々が見出した以上の研究成果を踏まえ、p300とNF-YBの直接の結合を確認するための実験を進めている。 2.PEの合成制御により細胞膜のホスファチジルコリン(PC)とPE比の異常が改善されるのか PCとPEは細胞膜を構成する主要なリン脂質である。PC/PE比の低下により発生したマウスの脂肪肝、肝不全がその量比を人為的に正常に戻すことで改善するという報告があるため、PC合成の律速酵素CTαのKO細胞を作成しPC、そしてPC/PE比を低下させる。そこにオキシステロールを投与しPEを低下させ、PC/PE比が正常に戻るのか確認する。また、PCを低下させたことによる細胞内のリン脂質組成の変化をLC-MS/MSを用いて評価する。上記を目的としてCTαのKO細胞を作成し、LC-MS/MSを用い細胞内のリン脂質の解析を行なっている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 免疫沈降法(IP)でのp300とNF-YBの直接の結合の確認、その結合が25-HCにより阻害されるかの検討が難航した。そのため、ETプロモーター領域に特異的に結合するタンパク質を解析できるDNA binding assay法を用いて検討を行なっている。新たな実験系を組み立てることに時間を要した。また、CRISPER-Cas9システムを用いてCTαKO細胞が樹立できた。現在LC-MS/MS(Sciex5500)を用いてCTαKO細胞のリン脂質組成の解析中である。
Strategy for Future Research Activity	p300とNF-YBの直接の結合を確認し、その結合が25-HCで阻害されるかどうか確認する。また同時に、p300とNF-Yが形成する巨大な転写因子複合体中に存在する他の因子を同定する。NF-YB抗体を用いてETプロモーター領域に結合する転写因子複合体を回収する。その複合体をnano LC-MS/MS (Sciex 6600) で解析し、構成タンパク質の詳細を同定する。さらに25-HC添加の有無により複合体を構成するタンパク質の違いを見出し、オキシステロールによる転写抑制機構にどのようなタンパク質が関与するのかを同定する。オキシステロールによる転写制御に関与するタンパク質が同定できた場合、オキシステロールとの直接の結合の有無を確認する。また、CTαKO細胞が樹立されたため、細胞内の脂質組成をLC-MS/MS(Sciex5500)で解析し、細胞内のリン脂質組成を確認している。PC/PE比が低下していた場合、細胞内にオキシステロールを投与してPE量を低下させ、PC/PE比が正常に戻るのか確認する。もし、PC量の低下が見られない場合はCTα以外のPC合成酵素のKO細胞を樹立し、検討する。
Causes of Carryover	研究の進捗が当初の予定よりも遅れたため、消耗品の使用額が予定より下回った。また、現地参加の予定であった学会にオンライン参加したため、旅費が不要となった。以上の理由により使用額が予定額を下回った。次年度も本年度と同様、生化学実験、細胞培養、また質量分析用の試薬などの消耗品として使用予定である。