2021 Fiscal Year Research-status Report
The molecular analysis of the structural basis of Notch1/Dll4 interaction for drug discovery.
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20K07330
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
穂積 勝人 東海大学, 医学部, 教授 (30246079)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Notchリガンド / Dll4 / Dll1 / 立体構造 / 胸腺 / パイエル板 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、Notchリガンド：Dll1とDll4の構造と機能の差異について、それぞれのキメラ分子を多数構築し、調べてきた。また、Dll1、Dll4誘導型遺伝子欠損（flox）マウスやCre依存的発現誘導マウスを用い、両分子の機能的差異や免疫応答における役割についても、検証している。今年度は、以下の知見を得ることができた。
（１）構造的差異 昨年度に見出したDSL領域C末側の２塩基の違いについて、それぞれDll1とDll4の置換変異体を作製し、機能を検証した。いずれも機能低下を認め、同塩基を含む構造が、Dll1/Dll4いずれの機能においても重要なDSL領域を特徴づけていることが明らかになった。また、Dll4のDSL領域を特異的に認識する、我々が独自に作製したmAbは、Dll4の同２塩基変異体にまったく結合せず、上記結論を支持した。
（２）Dll1/4の機能的差異のin vivo検証 胸腺上皮特異的Dll4欠損マウス（Foxn1-Cre、Dll4-floxed）を、Cre依存的Dll4発現マウスと交配することで、T細胞分化が回復することを示した。同様に、Dll1によっても回復し、Dll1が胸腺環境にて機能することが明確にできた。さらに、Notch1、Notch2欠損造血細胞を用いた骨髄キメラマウスによる解析から、Dll1は、胸腺にて、Notch1あるいはNotch2とのいずれにもシグナルを付与するのに対し、Dll4は、Notch1においてのみシグナル伝達を促した。以上の結果から、Dll1、Dll4間の機能的差異は、Notch受容体へのシグナル伝達能の違いに帰着することをin vivoにて示すことができた。
（３）パイエル板におけるNotchシグナルの意義 上記した遺伝子改変マウスを用い、パイエル板での生理的なTfh細胞の機能分化にNotchシグナルが重要であることを明確にした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Dll4がNotch1と結合する際の結合部位２箇所を、MNNL領域（Site １）に加えて、DSL領域（Site 2）でも明示することができた。特に後者においては、特異抗体を独自に保持しており、その構造・機能解析に有用なツールとなることが期待できる。両者を介した結合を特異的に制御できれば、Dll1と区別される、Dll4に特異的な薬剤の開発につながるものと考えられる。また、Dll1/4の相違によるT細胞分化誘導、NotchシグナルによるT細胞機能分化を検証するin vivo実験系にも、一定の目処をつけることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの成果をもとに、MNNL、DSL両者を同時に抑制することによる相乗効果について検証するとともに、in vivoモデルを反映した実験系にて、その効果を調べることに注力する。
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| Causes of Carryover |
今年度も、一部のプラスティック製品および試薬の納入が滞ったことで、消耗品費に差額が生じた。残額（129,603円）は、前年度に購入予定としていた製品（プラスティック消耗品、試薬）の購入に当てる。
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