2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the regulatory mechanism of integrin-harboring vesicles for the suppression of pathogenic vesicles
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20K07331
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
近藤 直幸 関西医科大学, 医学部, 講師 (30570840)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | インテグリン / 小胞輸送 / LFA-1 / inside-out / outside-in / 超解像イメージング / 全反射顕微鏡 / 一分子計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では, リンパ球の活性化やホーミングの過程において細胞間接着を介して重要な働きを担う接着分子である白血球インテグリンLFA-1を含む小胞の生成・輸送過程に注目し,その制御機構の解明を目指して実験を進めている。本年度は、前年度までに確立したスピニングディスク型超解像共焦点顕微鏡Dragonflyを用いたイメージング手法を用いて、様々な因子との共局在を超解像レベルで解析し、LFA-1の輸送に関わる因子をいくつか同定した。
前年度までの解析からLFA-1のリガンドであるICAM-1の結合依存的に誘導されるシグナル (outside-in シグナル)依存的にLFA-1細胞内小胞が顕著に形成されることをLFA-1に融合させたSNAPtagを生きた細胞内で共有結合により蛍光標識して可視化することにより明らかにしていた。
リンパ球にoutside-inシグナルをICAM-1やLFA-1の活性型構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて導入した後にパラホルムアルデヒドで固定しLFA-1含有小胞に局在する分子を蛍光免疫染色により調べたところ、この小胞にはRab7やRab8が特異的に共局在した。CRISPR-Cas9法を用いてRab7やRab8が欠損したリンパ球を作製し、その細胞接着能を調べたところ、接着能は野生型と比べて有意に低下した。さらに、細胞接着面におけるLFA-1の集積度合をLFA-1の機能に影響を与えない抗LFA-1抗体を用いて評価したところ、Rab7やRab8欠損リンパ球では集積が顕著に低下していることが明らかになった。以上の結果からRab7やRab8はoutside-in刺激依存的にLFA-1の接着面への輸送を制御する新規の因子であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LFA-1小胞輸送における新規の制御因子の同定に成功し、その制御機構の一端を明らかにすることができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
時空間的な制御の詳細を解明する目的で、本研究で同定された小胞輸送関連因子とLFA-1含有小胞を同時に可視化する実験系の確立を目指し、どのようにしてLFA-1がこれらの因子により輸送されているのかを明らかにする。Dragonflyを用いた二波長同時測定系は現在確立を進め、おおむね良好な結果が得られている。
また、これらの因子に対する初期培養細胞におけるノックアウト手法の確立やノックアウトマウスの取得、SNAPtagをLFA-1のC末端にノックインしたマウスの作製も進め、初期培養細胞においても、同定した小胞輸送関連因子群の重要性を調べる予定である。
これに並行して、使用の目途がついたため、質量分析を用いたLFA-1含有小胞の新規制御因子の網羅的な同定も感度のよい新型質量分析機器を使用して進め、LFA-1含有小胞輸送制御の包括的な理解を目指す。
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