2021 Fiscal Year Research-status Report

ストレス応答転写制御に果たす小Maf群因子の機能とがん悪性化との関連性

Research Project

Project/Area Number	20K07335
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	勝岡史城東北大学, 未来型医療創成センター, 教授 (30447255)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	Nrf2 / 小Maf / 転写制御
Outline of Annual Research Achievements	塩基性領域-ロイシンジッパー（bZIP）型転写因子であるCNC群因子と小Maf群因子（sMaf）のヘテロ二量体は、様々な生体防御遺伝子群の発現を制御する。また、CNC-sMaf二量体は、がん細胞の悪性化との関連も報告されている。ヒトを含む脊椎動物では、3種類のsMaf群因子（MafF, MafG, MafK）が同定されているが、各因子の機能の違いは充分解析されていない。本研究では、3種類のsMaf群因子の機能的な差異を明らかにすることを目的としている。研究手法としては、CNC群因子の一つNrf2とsMaf因子をリンカーペプチドで融合させたテザード分子を構築し、これをsMaf群因子の三重欠失細胞（MafF-/-:MafG-/-:MafK-/-）に導入することで、内在性のsMafを含む二量体の干渉を受けずに、導入したテザード二量体分子の機能を特異的に評価する手法（Tethered Dimer Rescue系）を用いる。令和3年度は、昨年度樹立したMafGのC末領域を欠失させたMafGΔCとNrf2のテザード分子（T-N2ΔC）の安定発現細胞株のRNAシークエンス等による機能解析を更に進めた。また、より信頼度の高いデータを得るため、テザード分子発現プラスミドのプロモーターを変更した新規のプラスミド構築を作成し、一連の機能解析を実施した。安定細胞株の樹立では、これまでのバルク培養ではなく、クローニングを実施することで、テザード分子の発現量を安定化した細胞株を樹立し、その機能解析を実施した。MafFとNrf2のテザード分子（T-N2F）のプラスミド構築も作成し、機能解析を実施した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 小Maf群因子間のアミノ酸保存性に着目し、C末欠失分子の評価を優先したプロジェクトの機能解析が順調に進んでいる。また、新規の発現系を採用したプラスミド構築、細胞株樹立法の変更などによって、今後、さらに信頼性の高い結果が得られるものと考えている。計画したMafFとNrf2のテザード分子（T-N2F）の解析も進捗している。従って、上記の進展と判断する。
Strategy for Future Research Activity	新規に構築したテザードNrf2-MafGΔC分子発現プラスミドを導入し、クローン化した安定発現細胞を用いた機能解析を進め、Nrf2-小Mafヘテロ二量体における小Maf分子C末端の機能を明らかにしていく。同時に、MafG分子C末端の機能については、テザード分子だけでなく、MafG分子単量体として機能も明らかにしていく予定である。また、テザードNrf2-MafFの機能解析も実施していく。
Causes of Carryover	採用した発現ベクターが、特定の薬剤処理によりmRNAレベルで発現が誘導される事が判明したため、異なるプロモーター系を用いた発現ベクター系を新たに構築した。またバルク培養ではなく、クローニングを実施する方針としたため、一定期間を要した。これらの変更により、より信頼性の高い結果が得られるものと期待されるが、RNAシークエンス等の解析の一部を令和4年度に実施する計画である。