多発性骨髄腫で転写因子IKAROSの不安定化を促進する新規化合物の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07351
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 落合 恭子 東北大学, 医学系研究科, 助教 (10455785)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 多発性骨髄腫 / IKAROS / クロマチン制御因子

Outline of Annual Research Achievements

転写因子IKAROSは、特異的な遺伝子発現ネットワークを形成することでリンパ球初期分化、B細胞の形質細胞分化を制御する。近年、形質細胞腫であるヒト多発性骨髄腫において、IKAROSタンパク質分解を誘導する抗がん剤レプラミドを用いた治療の有効性が示された。しかし、IKAROSはB細胞・T細胞・NK細胞などの免疫細胞分化にも重要であるため、レプラミドを用いた治療は免疫機能低下による感染症などの重篤な副作用が問題になる。この問題を解決するために、本研究では低濃度のレプラミドでも治療効果が得られるように、レプラミドとは異なる作用機序でIKAROSタンパク質を不安定化させる、レプラミドと併用可能な化合物の開発を目指している。
クロマチン制御因子PC4は、遺伝子発現の活性化とヘテロクロマチン誘導による遺伝子発現の抑制にはたらく。近年、私たちはPC4がB細胞でIKAROSと協調的に標的遺伝子発現を制御すること、PC4欠損マウスB細胞はIkarosの転写レベルは減少しないがIkarosタンパク質が減少することを見出した（Ochiai K. Cell Reports 2020）。さらに、ヒト多発性骨髄腫KMS12PE細胞でPC4遺伝子をノックダウンすると、IKAROSタンパク質が減少し、レプラミド単独よりも低濃度のレプラミドでもIKAROSタンパク質の減少を誘導することができた。このことから、PC4によるIKAROSタンパク質の安定化機構が存在すると考えられたので、その詳細な分子機構を解明し、レプラミドと併用でき、かつ治療に有効な化合物の開発を目指す。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

PC4とIKAROSが協調的に遺伝子発現を制御することから、PC4とIKAROS間結合によるIKAROSタンパク質安定化機構を想定した。当初の研究計画では、GST-タグ付PC4とHis-タグ付IKAROSを用いて直接的結合か間接的結合かを判断するGST-pull down assayを行う予定だったが、共同研究者から論文報告済のHis-タグ付PC4を得たので、GST-タグ付IKAROSを準備することにした。GST-pull down assayに先行し、PC4とIKAROSが相互するか確認することにした。そのために、Streptavidin-Flag-タグ付の全長型PC4レトロウイルス発現ベクターを構築し、多発性骨髄腫KMS12PE細胞で発現導入を試みた。しかし、KMS12PE細胞へのレトロウイルス感染およびトランスフェクションによる遺伝子導入効率が悪く、タグ付PC4発現株を樹立できなかった。そこで、ヒトとマウスのIKAROSタンパク質アミノ酸は相同性が92%以上と高いことから、内在性IKAROSを発現するマウス形質細胞株X63/0を用いてStreptavidin-Flag-タグPC4発現細胞株を樹立した。同細胞株から細胞全抽出液を調整し、Streptavidinビーズを用いてPC4を免疫沈降したところ、ヒストンは共沈したがIKAROSの共沈は確認できなかった。このことから、PC4とIKAROSは転写制御においては協調的に機能するが、PC4によるIKAROSタンパク質安定化は相互作用に依存しない可能性もある。進歩状況は、当初の計画以外の可能性が浮上してきたため、「やや遅れている」とした。

Strategy for Future Research Activity

ヒト多発性骨髄腫KMS12PE細胞の細胞抽出液を用いた内在性PC4とIKAROSの免疫沈降、繊維芽細胞293T細胞に作成済のタグ付PC4とIKAROS過剰発現させて抗タグ抗体での免疫沈降をおこない、PC4-IKAROS間結合の有無を慎重に確認する。これらの結果と上記の知見に基づき、PC4によるIKAROSタンパク質安定化がPC4-IKAROSタンパク質相互作用に依存していない可能性が高まった場合、その分子制御機構を掘り下げる。具体的な方法として、まずKMS12PE細胞でPC4をノックダウンし、IKAROSおよびIKAROSタンパク質分解に関与する因子のmRNA発現を調べ、発現変化の認められる因子をピックアップする。必要な場合、PC4ノックダウンによる遺伝子発現変化をマイクロアレイなどによって網羅的に解析する。また、既報のIKAROS発現制御に関与するシグナル分子とPC4の関連性にも注視し、最終目的であるレプラミドと併用できるIKAROSタンパク質不安定化薬剤の提案を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Chromatin Protein PC4 Orchestrates B Cell Differentiation by Collaborating with IKAROS and IRF4 (2020)
  • Author(s): Kyoko Ochiai, Mari Yamaoka, Amrutha Swaminathan, Hiroki Shima, Hitoshi Hiura, Mitsuyo Matsumoto, Daisuke Kurotaki, Jun Nakabayashi, Ryo Funayama, Keiko Nakayama, Takahiro Arima, Tomokatsu Ikawa, Tomohiko Tamura, Roger Sciammas, Philippe Bouvet, Tapas K Kundu, Kazuhiko Igarashi
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 33(12) Pages: 108517
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2020.108517
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research