2020 Fiscal Year Research-status Report
転写因子p63を介する外胚葉異形成症の病態機序解明とその調節因子の探索
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20K07364
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| Research Institution | Kobe Gakuin University |
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Principal Investigator |
鈴木 大介 神戸学院大学, 栄養学部, 講師 (10439698)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | TP63 (Trp63) / 上皮細胞 / 幹細胞 / 外胚葉異形成症候群 / 増殖 / 分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、これまでに外胚葉異形成症の亜型AECが転写因子p63のC末端領域 (Cα) の機能異常に起因することを明らかにしてきた。しかし、Cαを介した分子制御は不明であるため、Cαに存在するタンパク質結合モチーフに注目し、Cαに結合するタンパク質の同定を試みている。まず候補分子を探索するためにin vitroタンパク質結合アッセイを試み、その中でCαを介して結合するキナーゼ活性をもつ複数のタンパク質候補を得た。各候補はp63と相互作用し細胞内でp63分子と局在を共にすると想定されるため、組織学的な発現解析を行った。データベース解析および文献検索により、p63陽性細胞が存在する組織で発現が認められる3つの候補分子に絞り込み、これら3候補に対する特異的抗体を入手し、p63を認識する抗体とともに、ヒトの上皮組織および上皮腫瘍細胞株に対する二重染色を行った。その結果、p63が細胞核に強いシグナルを示す中で、候補分子の2つについては細胞内局在を特定する陽性シグナルが得ることができた。もう一つの候補分子については、今のところシグナルを得ることができず、検討を続けている。また、本候補分子にはp63をリン酸化修飾する機能が要求されるため、in vitro リン酸化アッセイを行うために、精製タンパク質を調製する準備を進めている。
この研究を進める中で、本年度はとくに、研究再開に向けて新規研究室の起動に取り掛かり、本研究費の支援によって細胞培養、組織免疫染色、タンパク質解析、PCRによるDNA増幅の基本的作業が可能な実験環境整備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Cαドメインに結合するタンパク質候補を絞り込み、発現解析を実施した。その結果、候補分子の細胞内局在データを得ることができ、p63発現様式との関係を推測できる段階に達している。従って、令和２年度の計画のうち目標の50%をクリアすることができている。その一方、新しく起動中の研究室環境において、精製タンパク質を調製する実験環境構築が大幅に遅れており、候補タンパク質がp63分子を修飾制御する機能的解析に進展がない現状である。これには、2020年初頭から見舞われた新型ウイルス感染症拡大が大きく影響しており、教育形態の変更から急遽、教育/研究エフォート・バランスの余儀ない変更と、そして検体輸送が滞っている状況から、実験環境構築が一部完全停止している背景が理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
候補分子がp63をリン酸化する機能を評価するために、in vitro リン酸化アッセイ系を準備する。そのために、候補分子やp63のタンパク質精製実験系の環境整備を進める。同時に、上皮培養細胞を用いて、候補分子によるp63分子の機能調節についても解析に着手する。そのために、候補分子を過剰発現あるいはノックダウンしたヒト上皮細胞の樹立を試みる。それら細胞株を樹立したのち、各候補分子がcell cycle制御にどのような影響を与えるか観察を行なっていく。
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| Causes of Carryover |
本年度より研究の再開に向けて実験室の整備に着手し、本研究費による支援のもと細胞培養、組織免疫染色、タンパク質の検出、エンドポイントPCRによるDNA増幅の基本的作業が可能な実験環境を構築しつつある。そのような中で、プラスミドからタンパク質を発現させ、精製タンパク質の調製に関わる実験系も起ち上げることを念頭に、DNAプレップをはじめとする遺伝子工学試薬の購入を計画していた。しかし、輸送の停滞による検体入手が滞っていることに加え、教育におけるオンライン対応により実験の進展に遅れが生じていることから、2020年度中の試薬購入を見合わせ、次年度に残額を繰り越すことにした。そのため、2021年度に入り、実際に実験を開始する直前に新鮮な試薬を発注する予定である。
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