2020 Fiscal Year Research-status Report

Crb3-PTPN3系を介した新規大腸腺癌転移制御機構の解析と転移阻害への応用

Research Project

Project/Area Number	20K07368
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	飯岡英和新潟大学, 医歯学系, 助教 (20425416)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	近藤英作新潟大学, 医歯学系, 教授 (30252951)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	Crumbs3 / 細胞極性 / 転移 / 浸潤 / 細胞移動 / 大腸癌 / PTPN3
Outline of Annual Research Achievements	一回膜貫通型タンパク質Crumbs3(Crb3)はモデル生物を使用した発生生物学的な研究から上皮組織の形態・機能の形成に必須の遺伝子であることが示されていた。我々は、ヒトの上皮から発生する悪性腫瘍の多くを占める腺癌に着目し、ヒト悪性腫瘍由来細胞株、及び患者由来悪性腫瘍組織切片を用いた免疫染色等を行い、腺癌の一部においてCrb3の発現が亢進していることを見出した。その後の解析からCrb3は線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）の活性化に寄与することで、大腸癌の転移を促進することを明らかにした。本研究では、Crb3による新規の転移促進メカニズムを明らかにすることを目的としている。Crb3タンパク質の細胞内ドメインのうち、転移に寄与すると考えられるFERM結合ドメインに注目し、相互作用する可能性のあるFERMタンパク質をクローニングして、in vitroでCrb3との結合を解析したところ、既知のCrb3結合タンパク質Ezrinに加え、非受容体型プロテインチロシン脱リン酸化酵素の一つPTPN3が相互作用することが判明した。PTPN3ノックアウト大腸癌細胞を作成したところ、Crb3ノックアウト細胞と同様に増殖性に変化は無いが、移動性が大きく損なわれることが判明した。また、PTPN3ノックアウト細胞株に野生型PTPN3を再度安定発現させた復帰発現株を作成したところ、移動性が回復した。また脱リン酸化活性を欠損した変異型PTPN3を発現させた細胞株では、移動性の回復は見られなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason PTPN3とCrb3とのin vitroの相互作用アッセイに加え、免疫沈降によりin vivoの相互作用を確認した。さらにPTPN3ノックアウト細胞の作成を予定通り行い、表現型についてもCrb3をノックアウトした場合と似た現象が確認できた。発現復帰株も作成し、野生型PTPN3の発現回復による移動性の回復が確認できたが、回復の割合としては非常低いものであった。この点についてはPTPN3を過剰発現させると増殖が抑制されるという報告もあり、低発現の発現系を用いる、発現量の低い細胞をクローニングして実験を行う、などの改善が必要と考えられた。当初予定していたCrb3とPTPN3の相互作用、PTPN3変異細胞の表現型解析を一通り完了することが出来たため、概ね順調に進展していると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	今度はまず、発現量や細胞内局在を指標として、Crb3とPTPN3との関連性と作用機序に関する手掛かりを得るための実験を行う。またPTPN3相互作用タンパク質の解析を網羅的に行うことで、Crb3-PTPN3系のによる癌細胞の移動・転移制御機構に迫る糸口を見出す。