2021 Fiscal Year Research-status Report

新規miR-143/p38キナーゼ経路の生体での調節機構と乳癌細胞における解析

Research Project

Project/Area Number	20K07431
Research Institution	Chubu University
Principal Investigator	岩本隆司中部大学, 生命健康科学部, 教授 (60223426)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	喬善楼中部大学, 生命健康科学部, 教授 (00343658) 岩田悟中部大学, 実験動物教育研究センター, 助教 (70722891)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	マイクロRNA / p38 / ゲノム編集 / miR-143
Outline of Annual Research Achievements	我々が樹立した心筋でmiR-143を高発現するαMHC/miR-143/145TGでは拡張型心筋症を発症するが、その心臓では、MAPキナーゼのp38タンパクの発現が低下する事実を報告してきた。2020年度はマウス受精卵のゲノム編集を用いてp38遺伝子の3'UTR上のmiR-143の2か所の標的配列をそれぞれ欠損したマウス(⊿Mup38　/3'UTRマウスa およびb)を樹立して解析した結果、p38タンパクの発現をほぼ半分低下させる領域を同定した。それで本年度はaおよびb双方を含む約３kbの領域cを欠損するマウス⊿Mup38/3'UTR(c)を樹立し解析した。その結果,αMHC/miR-143/145TGを⊿Mup38/3'UTR(c)と交配させると、p38の発現はほぼ野生型レベルまでに回復する事を見出した。これらの事実より、αMHC/miR-143/145TGにおけるp38の発現低下はp38遺伝子の約3kbの3'UTR(c)の領域に因っている事が明らかになった。 miR-143を高発現するαMHC/miR-143/145TG で見られるp38の発現低下に生理的な意味があるかどうかを検証する必要がある。その方法として、miR-143を欠損した⊿miR-143マウスにおいて、p38の発現が増強するかどうかを確かめる事を計画した。そこで、⊿miR-143マウスの作成を同様に受精卵のゲノム編集を用いて試みたが、なかなか欠損個体を得る事が出来なかった。そのため、ガイドRNAを設計し直し、再度試みた所、⊿miR-143マウスを一系統得る事が出来た。これらのマウスの内在性miR-143の発現を解析した所、内在性のmiR-143の発現が本来高くない心臓では変化が見られなかったが、内在性のmiR-143が高発現している膀胱等の平滑筋組織で明らかにp38の発現は増加していた。以上より、マウスp38の発現はmiR-143により制御され、少なくともそれはp38遺伝子の3'UTR内の約３kbの領域を介している事を明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 2020年度に引き続きヒトp38の3'UTR領域2.8kb の領域をマウスと置換したマウスHup38/3'UTRマウスの作成に時間がかかってしまっているのが最も大きな理由である。また、細胞株を用いた実験において安定した結果が得られていない。
Strategy for Future Research Activity	αMHC/miR-143/145TGの心臓で見られるp38の発現の低下のほぼ半分を説明可能な責任領域は決定でき、p38遺伝子の約３kbの3'UTR領域内で全て説明出来ることが解った。更に、miR-143を欠損したマウスでは平滑筋組織で、p38の発現が低下する事実を明らかにした事により、マウスではp38がERK5と共にmiR-143の標的となると考えられる。一方、ヒトのp38の3'UTRを欠損したHup38/3'UTRマウスは樹立に至っていない。2022年度はマイクロインジェクション法を整備して引き続き樹立を試みる。また実験の過程で、p38関連の別の分子が新たにmiR-143の標的となりうる事を示唆する実験結果を得たので、miR-143は当初の予想を超えたp38ネットワークを広く制御する事が予想され、その解析も並行して進める。また、細胞株における実験は、方法を再度デザインする必要があると考え、解決に努める。
Causes of Carryover	マウスの作成が予定通り進まなかったため。これらの実験は2022年度に持ち越す。