2021 Fiscal Year Research-status Report
大腸がん自然転移モデルを利用した転移関連遺伝子の探索
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20K07440
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| Research Institution | Aichi Cancer Center Research Institute |
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Principal Investigator |
藤下 晃章 愛知県がんセンター(研究所), がん病態生理学分野, 主任研究員 (50511870)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 転移 / 大腸がん / トランスポゾン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに4つの大腸がんに関連する遺伝子変異 Ctnnb +/loxEX3; Kras +/LSL-G12D; Trp53 lox/lox; Smad4 lox/loxを組み合わせることで、大腸がんを自然発生し肝臓へ転移するモデルマウス（CKPSマウス）の作出に成功している。一方、このモデルマウスは大腸がんを100%発症するが、肝臓へ転移する個体はそのうち20%程度であった。このことは大腸がんの転移には遺伝子変異に加えさらなる要因が必要であることを示唆している。
本研究ではPiggyBackトランスポゾンを利用した生体レベルでの機能的スクリーニングを実施し、大腸がんの転移に関わる遺伝子やシグナル経路について調査をしている。このトランスポゾンによるスクリーニングは腫瘍細胞でトランスポゼースが活性化し、遺伝子の発現を上昇または抑制する配列がランダムにゲノム上を移動する仕組みである。CKPSマウスとトランスポゾンマウスを交配し、作出されたマウスは大腸がんの発症頻度がおよそ40%に上昇した。このことから、トランスポゾンが挿入された近傍の遺伝子が大腸がん細胞の転移を促進または抑制させる可能性が考えられる。これまでに次世代シークエンスにより得られたトランスポゾン挿入部位の情報から複数の候補遺伝子を同定しており、それぞれの遺伝子と大腸がん細胞の転移との関わりについて解析を実施している。一昨年度には、既に大腸がん細胞の転移を促進させることが報告されているDDR1を見出し、このスクリーニングシステムが機能していることを確認した。昨年度は翻訳と関わりのある遺伝子Xについて解析を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
次世代シークエンスにより得られたトランスポゾン挿入部位の情報から、翻訳に関連する遺伝子Xの発現上昇が転移に寄与することが推測された。大腸がん転移モデルマウス（CKPSマウス）由来の大腸がん細胞株に対し、レンチウィルスベクターにより過剰発現させた細胞を作成した。この遺伝子操作した細胞をマウスの脾臓から移植する肝転移モデルにより、候補遺伝子Xの肝転移巣形成に対する評価を行なったところ、GFPを過剰発現させたコントロール細胞よりも多くの転移巣を形成した。
この翻訳に関わる候補遺伝子Xの詳細な機能を検証するため、siRNAによるノックダウンを実施し、プロテオーム解析を実施することで候補遺伝子Xの発現低下によって変動するタンパクを網羅的に調査した。ノックダウンした細胞ではリボソーム関連タンパク群の低下、つまり候補遺伝子の機能であるタンパクの翻訳/合成が阻害されていることをプロテオーム解析から確認できた。さらにリボソーム関連タンパク以外に、コレステロールに関連するタンパクYの低下がノックダウンした細胞で確認された。このタンパクYと臨床大腸がん患者の相関を調べたところ、このタンパクYの遺伝子発現が高い大腸がん患者では生存期間が短いことが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに同定した候補遺伝子XがタンパクYの発現制御機構とタンパクYの大腸がん転移おける役割について次の検討を行う。CKPSマウス由来の大腸がん細胞に対してCRISPR-Cas9によるノックアウトを実施する。作出したタンパクY ノックアウト細胞をマウスの脾臓から移植し、肝転移巣形成数の測定と組織学的解析を実施する。
タンパクYの発現制御機構については、CKPSマウス由来の大腸がん細胞に対して候補遺伝子XをsiRNAによりノックダウンし、 mRNAの発現を検証するすることで、転写レベルの制御について調査する。
さらにキナーゼアレイを実施し、候補遺伝子Xによって変動する細胞内のシグナル経路を同定し、タンパクYの関係について調査する。
これらの解析結果から遺伝子XとタンパクYの関係が確認されれば、論文作成し投稿する。
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| Causes of Carryover |
想定していたよりも安い値段で試薬等を入手できたこと、予想よりもスムーズに研究が進んだことから、予定額を使用せずに研究が遂行できた。そのため次年度の研究費として使用する予定である。
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Research Products
(3 results)
