2020 Fiscal Year Research-status Report
腸管出血性大腸菌特異的な生体防御機構抵抗因子の同定と機能解析
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20K07474
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
清水 健 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (70312840)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
濱端 崇 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 細菌感染研究室長 (40311427)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | EHEC / 生体防御機構抵抗因子 / 一酸化窒素(NO) / NO消去酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は腸管出血性大腸菌(EHEC)特異的な未知生体防御機構抵抗因子を特定して、詳細な機能解析を行うことである。EHECを含めた大腸菌にはNOの殺菌効果を減弱させる３種類のNO消去酵素が存在する。嫌気的な条件でNOを還元的に消去することが可能なNorV, Hcp、そして好気的な条件でNOを酸化的に消去することが可能なHmpが存在する。大腸菌はこれら３種類のNO消去酵素によってマクロファージなどによって産生されるNOの濃度を減少させており、腸管内での増殖や生存に関係していると思われている。実際、非病原性大腸菌BL21株を用いて、これら３種類のNO消去酵素を欠失させた菌株と野生株を用いて、マウス腸管内での菌数の減少を比較したところ、３種類のNO消去酵素を欠失させた菌株は野生株と比較して優位に菌数が減少した結果を得ていた。そこでEHECの標準株であるO157 Sakai株を用いて３種類のNO消去酵素遺伝子を欠失したEHEC変異株を構築した。同様に非病原性大腸菌BL21株においても３種類のNO消去酵素遺伝子を欠失した大腸菌変異株を構築した。次に、Sakai株由来の３重変異株を培養してゲノムDNAを調製した。そのゲノムDNAをSauIIIAIで部分消化し、30-40 kbのDNA断片を精製した。そして、Caromidを用いてゲノムライブラリーを構築し、これを非病原性大腸菌BL21株で、なおかつ３種類のNO消去酵素遺伝子を欠失した３重変異BL21株に形質導入して、EHECの未知生体防御機構抵抗因子遺伝子を保持した大腸菌ライブラリーを調製した。現在、これをin vivoスクリーニングによって未知生体防御機構抵抗因子を特定する直前の状態になっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
腸管出血性大腸菌の３重変異株は作製できている。また、スクリーニングに使用予定の宿主大腸菌である非病原性大腸菌BL21の３重変異株の作製も終わっており、これらの菌株の性状の確認をすることができている。また、腸管出血性大腸菌の３重変異株からゲノムDNAも精製して、ライブラリーの作製に適したDNAの調製ができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はマウスを用いた動物実験を行うが、まずは腸管出血性大腸菌の野生株と３重変異株、および非病原性大腸菌の野生株と３重変異株の腸管内での生存率の比較を詳細に行う。これに関しては予備実験で非病原性大腸菌では野生株と３重変異株で生存率に差が確認できたが、腸管出血性大腸菌では差が認められなかった。その時にどのようなマウスを用いたら、どのような実験条件の時に非病原性大腸菌を用いた時の差が最も認められるかを確認し、その最適な条件で腸管出血性大腸菌が保持する未知の生体防御抵抗因子のスクリーニングを行う。これによって、効率的に生体防御抵抗因子遺伝子を含んだDNA領域が明らかになることが期待できる。
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| Causes of Carryover |
今年度はコロナウイルス感染症の影響で学会等の開催が限定され、また開催されてもオンラインでの開催と旅費を必要としなかった。また、共同研究者との打ち合わせもオンラインで行ったことから、共同研究のための旅費も必要でなかった。このために昨年度の使用金額は当初考えていた予算には達しなかった。次年度はそのようなことも多少は解消されると思うので、そのような状況になったら、次年度に繰り越した金額を効率的に使って、研究を進展させていく予定である。
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Research Products
(2 results)
