2022 Fiscal Year Annual Research Report

腸管出血性大腸菌特異的な生体防御機構抵抗因子の同定と機能解析

Research Project

Project/Area Number	20K07474
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	清水健千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (70312840)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	濱端崇国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 細菌感染研究室長 (40311427)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	腸管出血性大腸菌 / 病原性
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的はEHEC特異的な未知生体防御機構抵抗因子を特定して、詳細な機能解析を行うことである。 EHEC特異的な生体防御機構抵抗因子を明らかにするために、３種類のNO消去酵素遺伝子を欠失したEHEC変異株を構築し、このゲノムDNAを用いてプラスミドライブラリーを構築した。これを３種類のNO消去酵素遺伝子を欠失した大腸菌変異株に形質転換した。この大腸菌ライブラリーに対して嫌気条件でNO処理を行い、生き残ったクローンを回収するためにLB平板に広げた。濃縮されたクローンが保持するプラスミドのインサートDNAをPCRで増幅し、塩基配列を決定した。その結果、28クローンのインサートDNAには、３カ所のDNA領域が重複して複数のクローンに存在していた。そこで、この領域が機能的であるかどうかを確認するために、個々のクローンのNO抵抗性が上昇しているかどうかを確認したところ、それらのクローンはNOに対する抵抗性を上昇させていた。次に、陽性クローンの責任DNA領域を明らかにしたところ、O157特異的なプラスミドであるpOSAK1の一部でああった。さらに、NO抵抗性の責任遺伝子を明らかにするために、欠失変異プラスミドを用いて解析し、RNA結合タンパク質をコードしているrop遺伝子であることが明らかになった。このRopタンパク質はプラスミドの複製に関与している２種類のRNA分子と相互作用することが示されていたが、EHECの生体防御機構抵抗因子として働くことは示されていなかった。Ropタンパク質はEHECのsmall RNAを介した生体防御抵抗機構の増強に関与していると思われるが、その作用機序の詳細は明らかになっていない。今後はRopタンパク質によるEHECの生体防御抵抗性増強機構の詳細について明らかにする。