2020 Fiscal Year Research-status Report

黄色ブドウ球菌の新規TAシステムによる細胞死制御とパーシスター形成の解明

Research Project

Project/Area Number	20K07480
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	加藤文紀広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (70452589)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	岡広子広島大学, 医系科学研究科(歯), 特任講師 (60452588)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	黄色ブドウ球菌 / 膜タンパク質 / 細胞死
Outline of Annual Research Achievements	トキシン・アンチトキシン(TA)システムは、細菌において広く保存されている機構であり、自身の細胞機能を停止させ細胞死を誘導するトキシンと、そのトキシン活性を中和するアンチトキシンから成る。細菌の保有するTAシステムが、ストレス応答、病原性、バイオフィルム形成、薬剤感受性や薬剤抵抗性に関与することが知られている。本研究は、新規に見出した黄色ブドウ球菌のTAシステムTsaA/TsaTが、黄色ブドウ球菌細胞内のどこで、どのように（活性部位、標的、メカニズム）機能して細胞死を誘導するのか、および黄色ブドウ球菌においてどのような生理的な役割を有しているのかを解明する事を目的としている。初年度として当該年度は、1) TsaAアンチトキシンおよびTsaTトキシン、両タンパク質の黄色ブドウ球菌細胞内における局在の同定、2) アンチトキシン活性に重要なTsaAタンパク質のアミノ酸残基の同定、3) 黄色ブドウ球菌における生理学的な役割を解析するためにTsaA/TsaT遺伝子欠損株を用いて薬剤感受性試験を計画し研究を実施した。その結果、TsaTトキシンおよびTsaAアンチトキシンの両タンパク質が黄色ブドウ球菌細胞の膜タンパク質画分に存在する事を明らかにした。これまでにトキシンおよびアンチトキシンの両方が膜タンパク質から成るTAシステムは報告がなく、新規なTAシステムの機構である事を明らかにした。さらに、大腸菌を用いた解析により、アンチトキシンであるTsaAの28番目のリジンおよび63番目のグルタミン酸がアンチトキシン活性に重要である事を明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason TsaTトキシンおよびTsaAアンチトキシンの黄色ブドウ球菌細胞内における局在を明らかにする事を目的に、FLAGタグを融合したTsaTトキシン、またはTsaAアンチトキシンのどちらか一方を黄色ブドウ球菌で発現させ、超遠心による細胞分画後、Tricine-SDS-PAGEおよび抗FLAG抗体を用いたWestern blotting法により細胞内局在を解析した。その結果、トキシンおよびアンチトキシンの両タンパク質が黄色ブドウ球菌の膜タンパク質画分に存在する事を明らかにした。これまでにトキシンおよびアンチトキシンの両方が膜タンパク質からなるTAシステムは報告がなく、新規な機構を有するTAシステムである事を明らかにした。さらに、大腸菌を用いた解析により、アンチトキシンであるTsaAタンパク質の28番目のリジン残基および６３番目のグルタミン酸残基がアンチトキシン活性に重要である事を明らかにした。
Strategy for Future Research Activity	遺伝子欠損株および遺伝子過剰発現株を用いて、TsaA/TsaTの黄色ブドウ球菌における生理的な役割の解明をするために、病原性因子産生、薬剤感受性、バイオフィルム形成、RNA seqによる網羅的遺伝子発現を解析する。特に、薬剤抵抗性を有するパーシスター形成および種々の酸化ストレス（過酸化水素、次亜塩素酸、パラコート）を作用させた際のTsaTトキシン活性を解析する。また、TsaTトキシンタンパク質にアラニン置換を導入しトキシン活性を解析し、活性部位の同定およびアンチトキシンとの作用メカニズムの解明を実施する。