2020 Fiscal Year Research-status Report
Molecular mechanisms of viral uncoating in influenza A virus and HIV-1
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20K07513
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
三宅 康之 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (10452294)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / M1 / HIV-1 / CA / TNPO1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はA型インフルエンザウイルスが細胞内に侵入する過程でウイルスゲノムのアンコーティング（脱殻）に機能する宿主核輸送因子TNPO1とウイルスの殻を構成するM1タンパク質の複合体分子構造を明らかにすることを目的としている。また、TNPO1はHIV-1のキャプシドタンパク質CAの脱殻にも関与していることが報告されており、ウイルスを超えた共通の分子メカニズムが存在すると考えられる。これらの分子の相互作用はウイルスの宿主への感染に重要であり、この相互作用を阻害する低分子化合物などの探索により新たな創薬に繋がることが期待される。
これまでにこの複合体解析のための、個々のタンパク質精製を試みた。TNPO1は大腸菌および昆虫細胞での発現を確認することができなかったため、今後は発現条件の詳細な検討、哺乳類細胞内での発現を試みる予定である。M1タンパク質は昆虫細胞による発現系で発現を確認し、精製を試みた。
しかし、生化学的、構造生物学的解析に十分な量は得られていない。一方で、HIV-1のキャプシドを構成するCAタンパク質を大腸菌内で発現、精製を行ったところ、大量精製が可能であった。精製したHIV-1 CAタンパク質を高塩濃度の緩衝溶液中で反応させることで、チューブ構造を形成することが報告されている。実際にチューブ形成反応をさせ、電子顕微鏡下で負染色により観察したが、チューブ構造を確認することはできなかった。CAタンパク質は高塩濃度下で容易に凝集体を形成することを確認し、現在条件検討を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
大腸菌および昆虫細胞発現系によるタンパク質発現および精製実験のセットアップに時間を要した。ヒトTNPO1を大腸菌(BL21(DE3))および昆虫細胞(Sf9)内で発現を試みたが、Westernブロッティングにおいてもタンパク質の発現を確認することができなかった。また、インフルエンザウイルスM1タンパク質は大腸菌および昆虫細胞内で発現を試みた。昆虫細胞発現系では、CBB染色レベルでの発現が確認され、目的のM1タンパク質であることを特異的抗体を用いたWesternブロッティングにより確定した。現在、大量精製のためにバキュロウイルスを増幅させている。
HIV-1のCAタンパク質をpETベクターに組込み、大腸菌BL21(DE3)内で発現を試み、大量精製が可能であった。精製用ヒスチジンタグをTEVプロテアーゼにより除去し、ゲル濾過による精製を行なった。その結果、単粒子解析または結晶化できると考えられる純度までの精製が可能となった。HIV-1 CAタンパク質の高純度での精製が成功したため、TNPO1との相互作用解析および電子顕微鏡による負染色で、HIV-1 CAのチューブ構造の形成に影響を与えるかどうか、検討を行なった。現在までに、HIV-1 CAのチューブ構造は見られず、チューブ形成の反応条件を検討中である。HIV-1 CAタンパク質は高塩濃度で速やかにアグリゲーションを起こしていることを確認している。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き宿主核輸送因子TNPO1およびインフルエンザウイルスM1タンパク質の複合体解析を目的とし、タンパク質発現を試みる。同時に２つのプラスミドを昆虫細胞もしくは哺乳類細胞内で共発現し、安定した複合体として精製できるか、検討する。また、複数の遺伝子発現を同時に行うことのできるMultiBac systemを用いた昆虫細胞内発現系を試し、２つの因子を同時発現させるBacmidを作製し、昆虫細胞内での発現を試みる。可能であれば、個々の因子についても発現条件の検討を行う予定である。個別に発現を確認したM1タンパク質に関しては、今後はバキュロウイルスの感染力価を上げ、タンパク質発現の条件を検討する。また、ブリストル大学の山内洋平博士らとの共同研究によりM1タンパク質に対する抗体様低分子を作製し、M1とTNPO1との相互作用を阻害するかどうか、検討する。そこでまずM1タンパク質のGly18を含む断片を大腸菌発現系にて精製し、抗原として利用する予定である。
HIV-1 CAタンパク質のチューブ形成条件を検討し、チューブ形成反応にTNPO1タンパク質がどのような影響を与えるのか、電子顕微鏡下で観察する。また、TNPO1とCAの分子間相互作用を生化学的手法により確認する。
エボラウイルスの殻を構成するタンパク質もインフルエンザM1やHIV-1 CAと同様のTNPO1結合モチーフを有することが配列上明らかとなっている。そこで、エボラウイルスの殻を構成する因子の発現、精製を試みる予定である。
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