Elucidation of virus multiplication mechanism by a novel hepatitis B virus replication system using stabilized polymerase

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07515
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 坂口 剛正 広島大学, 医系科学研究科(医), 教授 (70196070)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 東浦 彰史 広島大学, 医系科学研究科(医), 助教 (90598129)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: HBVプレゲノム / センダイウイルス / 安定化HBVポリメラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

開始点の異なる２種類のHBVプレゲノムを発現する遺伝子組換えセンダイウイルスを作製した。開始点は、本来の位置であるpreCore蛋白質の翻訳開始点とcore蛋白質の翻訳開始点の間（pregenome RNA: pgRNA）と、preCore蛋白質の翻訳開始点の上流（upstream pregenome RNA: UpgRNA）である。これらについて作製した組換えセンダイウイルスの挿入配列の塩基配列を確認した。一方、安定化HBVポリメラーゼ発現センダイウイルスについては、内部の塩基配列に誤りが見つかったので、現在、再作製を進めている。
SeV-pgRNAを感染させたHepG2細胞では、予想に反してHBV複製は観察されなかった。一方で、SeV-UpgRNAと同様に、安定化HBVポリメラーゼを発現するプラスミドを導入した場合にHBV複製が観察された。
この理由は不明であるが、SeV-pgRNAでは発現するRNAの5’端には、capおよび余分なスペーサー配列が、3’端にはpolyA配列が付加しているので、これが理由である可能性がある。5’端および3’端にリボザイム配列を付加して、合成後に余分な配列を切断除去できるプレゲノムRNAを発現するセンダイウイルスを作製することが必要かもしれない。
また、プレゲノムRNAの終止点は本来の位置であるpolyA付加配列であるが、プラスミドを用いる場合には、さらに延長して、1.4倍長ゲノムなどにするとウイルスが生成する率が高まることが報告されている。本研究でも、繰り返したゲノム配列を導入することを検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウイルスの流行に際して、広島大学、広島県、AMED等と協調して、SARS-CoV-2の分離培養、塩基配列解析、試験方法および薬剤の開発に従事したために、当該研究の遂行が遅延した。また、完成が見込まれたHBVポリメラーゼ発現センダイウイルスの挿入遺伝子配列に間違いが見つかり、再作製を余儀なくされた。

Strategy for Future Research Activity

安定化HBVポリメラーゼ発現センダイウイルスを作製することを目指す。外部委託で同ウイルスを作製することも検討する。この場合、カルタヘナ法遵守のために非増殖性センダイウイルスをベースとすることになる。また、トランスフェクションの効率が高い培養細胞では、安定化HBVポリメラーゼ発現プラスミドを使用できるので、プラスミドを用いて実験を進める予定である。
HBVプレゲノムRNA発現センダイウイルスについても、プレゲノムRNAの両端から余分な配列を除去する、あるいは終止部を延長してゲノムの繰り返し配列を含むRNAを生成することを検討する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの検査業務および研究開発のために、本研究の遂行が遅延したために次年度使用額が生じた。今年度は、既存の安定化ポリメラーゼ発現プラスミドを用いてHBV複製の研究を推進するとともに、安定化ポリメラーゼ発現センダイウイルスの作製、プレゲノム発現センダイウイルスの改良を行う。これによって研究の遅れを取り戻す予定である。