2020 Fiscal Year Research-status Report
サイトカイン分泌経路を逆利用したHIVタンパク質輸送と細胞間伝播
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20K07518
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
森川 裕子 北里大学, 感染制御科学府, 教授 (20191017)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | HIV / Gag / サイトカイン / 輸送経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）HIV-1増殖：STX6ノックダウン（KD）およびノックアウト（KO）の、Jurkat細胞（T細胞系）、U937細胞（単珠系）、THP-1細胞（単珠系）を樹立した。コントロール細胞に比べ、これらのSTX6 KDおよびKOの細胞ではHIV-1産生の抑制が認められた（ELISAで測定）。すなわち、免疫系細胞においてもSTX6はHIV-1産生に関与することが確認された。
２）TNFa分泌：これらの免疫系細胞ではHIV-1感染によりTNFa分泌量が増加した（ELISAで測定）。また、コントロール細胞に比べ、STX6 KD/KO細胞ではTNF分泌量が低かった。すなわち、STX6はTNFa分泌輸送に関与することが判明した。
３）細胞内共局在および共輸送：免疫染色ではこれらの細胞の内在性STX6やTNFaの検出は難しかった。一方、HeLa細胞ではGagと内在性STX6の共局在が共焦点顕微鏡で確認できた。また、蛍光タンパク質で標識した場合でも、Gag-SrawberryとTNF-EGFP、Strawberry-STX6とTNF-EGFPの共局在が確認できた（共焦点顕微鏡で観察）。さらに、生細胞分子イメージングでは、これらの蛍光タンパク質が細胞質内で共輸送されることが確認された。以上より、免疫系細胞での観察の場合も蛍光タンパク質での標識が必要と思われた。
４）膜小胞分離：HeLa細胞に、Gag-FLAGとHA-TNFa、FLAG-STX6とHA-TNFaを共発現させ、免疫沈降によりGagあるいはSTX陽性膜画分を分離したところ、HA-TNFaの含有が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１）Cherry-STX6発現Jurkatを樹立し、Gag-EGFPとの共局在を解析する予定であったが、まず内在性のSTX6との共局在を解析する実験を組み入れた。そのため、Cherry-STX6とGag-EGFPの共局在解析は2021年度実施となった。
２）Jurkat細胞を用いる予定であったが、TNFはT細胞系よりマクロファージ系からよく産生されることがELISAで判明したため、単球系のU937, THP-1細胞を用いることに変更した。
３）一方、2021年度実施予定の「STX6 KD/KO細胞におけるTNFa分泌」については、2020年度にKD/KO細胞が樹立できTNF分泌量がELISAで測定できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）免疫系細胞（T細胞や単球系細胞）では、免疫染色で内在性のSTX6やTNFを検出することは難しかった。従って、当初の計画通り蛍光タンパク質で標識したSTX6やTNFaの発現細胞を樹立して解析する。TNFaはその細胞毒性を考慮し、誘導発現型にする。
２）感染細胞からの産生されるTNFaにより標的細胞が誘引されるかを、transwellを用いたtransmigration assayとタイムラプスで解析する予定である。transmigration assayは蛍光による定量解析を確立している。
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Research Products
(1 results)
