2021 Fiscal Year Research-status Report

サイトカイン分泌経路を逆利用したHIVタンパク質輸送と細胞間伝播

Research Project

Project/Area Number	20K07518
Research Institution	Kitasato University
Principal Investigator	森川裕子北里大学, 感染制御科学府, 教授 (20191017)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	HIV / Gag / サイトカイン / 輸送機構
Outline of Annual Research Achievements	１）宿主因子STX6の役割： STX6ノックダウン（KD）やノックアウト（KO）によりHIV－１産生が抑制されるとともに、TNFa分泌が減少した（前年度確認済み）。２）TNFa分泌：免疫系細胞（T細胞系と単球系）ではHIV-1感染によりTNFa分泌が増加することが判明した（ELISAで測定）。Nefタンパク質によるTNFa分泌が示唆されているが、Nef欠損HIV-1を用いた場合でもTNFa分泌は増加した。３）細胞内共局在および共輸送：HIV-1感染単球系細胞（U937とTHP-1細胞）ではHIV-1 Gagタンパク質と内在性TNFaの共局在が示された。HeLa細胞でもGagタンパク質と内在性STX6の共局在が確認できた。また、蛍光タンパク質で標識したGag、TNFa、STX6を用いて、共焦点顕微鏡でこれら３つの共局在を、生細胞イメージングでGag-STX6、STX6-TNFa、Gag-TNFaの共輸送を明らかにした。微小管破壊によりこれらの輸送は停止した。４）Gag、STX6、TNFaの相互作用：Gag、STX6、TNFa発現細胞から調製した膜画分の免疫沈降、可溶化後の免疫沈降、pulldown assayにより、Gag-STX6の直接結合（Gag MA domainとSTX6 SNARE domainを介する）、STX6とTNFaの直接結合（STX6 C末端領域とTNFa細胞質尾部を介する）、Gag-TNFaの膜を介する相互作用が示された。これらからトポロジーモデルを作成した。５）感染シナプス：STX6 KDおよびKO細胞を用いて、感染細胞と標的細胞の接着による感染シナプス形成（Gagタンパク質の集積）を観察した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason １）T細胞系（Jurkat細胞）を用いる予定であったが、TNFaはマクロファージからより分泌されるため、単球系（U937, THP-1細胞）を用いることに変更した。２）単球系細胞（U937とTHP-1細胞）で内在性TNFaの免疫染色・蛍光観察ができたため、tet-on誘導型の蛍光タンパク質標識TNFaの発現細胞樹立を後回しにした。従って、免疫細胞での生細胞イメージングはできていない。HeLa細胞ではGag-STX6、STX6-TNFa、Gag-TNFaの共輸送と微小管系輸送が確認できた。３）Gag、TNFa、STX6の３つの共局在が形質膜でも観察され、またSTX6のHIV粒子への取り込みも観察された（TNFaについても検討する予定）。４）感染シナプス（感染細胞と標的細胞の接着により形成される構造）におけるGagタンパク質の極性輸送をSTX6 KDおよびKO細胞を用いて解析できた。TNFaの極性輸送は現在検討中。HIV感染細胞からのTNFa産生と標的細胞の誘引については次年度解析する。
Strategy for Future Research Activity	１）形質膜出芽HIVにおけるSTX6とTNFaの取り込みは、細胞の共焦点顕微鏡観察と精製HIV粒子の分析で解析する。２）感染シナプス（単球系-T細胞系の組み合わせを用いる予定）におけるGagタンパク質とTNFaの極性輸送を観察する。３）感染細胞からの産生されるTNFaにより標的細胞が誘引されるかを、transwellを用いたtransmigration assayとタイムラプスで解析する（感染U937細胞-標的Jurkat細胞の組み合わせを用いる）。
Causes of Carryover	論文投稿が遅れたため今年度内での論文掲載料が発生せず、次年度に繰り越しとなった。