サイトカイン分泌経路を逆利用したHIVタンパク質輸送と細胞間伝播

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07518
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 森川 裕子 北里大学, 感染制御科学府, 研究員 (20191017)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: HIV / Gag / サイトカイン / 輸送機構

Outline of Annual Research Achievements

【HIV-1増殖におけるSTX6の役割】HeLaおよび293T細胞ではSTX6ノックダウン（KD）によるHIV-1粒子産生抑制を既に確認している。また、HeLaおよび293T細胞ではHIV-1 Gagタンパク質とSTX6の共局在および共輸送も既に確認している。これらを免疫細胞で調べた。STX6 KD／ノックアウト（KO）の免疫細胞（JurkatおよびU937細胞で）はHIV－１複製が抑制された。またこれらのSTX6 KD／KO細胞ではHIVの粒子形成も抑制された。免疫細胞（U937とTHP-1細胞）ではGagタンパク質とSTX6の共局在が観察された。
【TNFa輸送と分泌】免疫系細胞（Jurkat、U937、THP１細胞）では、HIV-1感染によりTNFa分泌が増加した。ところが、STX6を欠損させるとHIV-1感染によるTNFa分泌増加は認められなくなった。蛍光タンパク質で標識したGag、TNFa、STX6を用いてこれら３つの共局在と、Gag-STX6、STX6-TNFa、Gag-TNFaの共輸送を明らかにした。
【Gag、STX6、TNFaの相互作用】Gag-STX6の直接結合（Gag MAの第5ヘリックスとSTX6 SNAREドメイン）、STX6とTNFaの直接結合（STX6 C末端とTNFa細胞質尾部）が示された。Gag-TNFaは直接結合しなかった。
【感染シナプス】免疫細胞ではSTX6およびTNFaは形質膜全体に局在した。シナプス極性輸送は観察できなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

【免疫細胞】T細胞系（Jurkat細胞）を用いる予定であったが、TNFaはマクロファージからより分泌されるため、単球系（U937, THP-1細胞）を用いることに変更した。
【TNFa局在】免疫系細胞（Jurkat、U937、THP１細胞）では、HIV-1感染によりTNFa分泌が増加した。免疫細胞（U937とTHP-1細胞）を用いて内在性TNFaの局在が観察できた。従って、誘導型の蛍光タンパク質標識TNFaの発現細胞は樹立しないことにした。免疫細胞での生細胞イメージングはできないが、樹立できても得られる情報が少ないため。
【Gag、STX6、TNFaの相互作用】Gag-STX6の結合部位（Gag MAの第5ヘリックスとSTX6 SNAREドメイン）、STX6とTNFaの結合部位（STX6 C末端とTNFa細胞質尾部）が特定できた。
【感染シナプス】TNF1aはシナプス極性に輸送されない可能性が示唆された。さらに確認し決定する予定。

Strategy for Future Research Activity

【Gag-TNFaの相互作用】Gag-TNFaの間接的な相互作用（STX6を介する）を明らかにするため、MA欠損GagによるTNFa分泌を解析する。また、Gag発現によりTNFa分泌が増加するかを
【TNFaによる標的細胞の誘引】感染細胞からの産生されるTNFaにより標的細胞が誘引されるかを、transwellを用いたtransmigration assayとタイムラプスで解析する。

Causes of Carryover

コロナの影響でHIV抗原定量ELISAキットの製造が遅れており、入手に時間がかかった。従って、論文投稿も遅れ、今年度内での論文掲載料が発生せず、次年度に繰り越しとなった。