腸管オルガノイド培養系を用いたヒトノロウイルス感染制御因子の探索

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07520
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 林 豪士 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 主任研究官 (80824648)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ヒトノロウイルス / 腸管オルガノイド / 自然免疫 / siRNA / インターフェロン / RNAseq / CRISPR-Cas9

Outline of Annual Research Achievements

本研究代表者は、ヒトノロウイルス(HuNoV)感染時における宿主免疫機構の解明を念頭に置いた研究を展開している。本研究ではin vitroにおいてHuNoVを安定的に増殖させることが可能な幹細胞由来腸管上皮オルガノイド培養系を利用して、HuNoV感染制御因子を同定することを目的とした。
初年度は、申請者が確立した単層腸管オルガノイドへのsiRNA導入法を用いて、自然免疫関連遺伝子のsiRNAスクリーニングを行うことで、HuNoV感染を阻害する候補因子を選別することを計画した。まずポジティブコントロールとなり得る一部の自然免疫関連遺伝子についてsiRNAを購入し、リバーストランスフェクション法により単層腸管オルガノイドへの導入を試みたところ、65%程度ノックダウンすることに成功した。しかしながら、当初期待していた、遺伝子ノックダウンによるHuNoVの増殖効率の上昇、あるいはインターフェロン応答の低下といった知見は現時点では得られておらず、より効率の良い遺伝子ノックダウンの系が必要であることが示唆された。
さらに初年度において、siRNAスクリーニングとは異なる系でHuNoV感染阻害候補因子を選別することを目的として、HuNoV感染・未感染細胞での遺伝子発現をRNAseq解析により網羅的に評価した。その結果、HuNoV感染によりインターフェロン応答に関わる遺伝子群など、特定の遺伝子群の有意な発現上昇が認められ、これら遺伝子がHuNoV感染制御因子として働いている可能性が示唆された。現在、HuNoV感染により発現が上昇した一部の遺伝子について、CRISPR-Cas9法により遺伝子ノックアウト腸管オルガノイドの作製を試みている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度に予定していたsiRNAスクリーニングによるHuNoV感染を抑制する候補因子の選別は実施できなかったが、RNAseq解析によりある程度候補因子を絞りこむことに成功したため、「やや遅れている」とした。

Strategy for Future Research Activity

RNAseq解析により絞り込んだ候補遺伝子に関して、CRISPR-Cas9法により遺伝子ノックアウト腸管オルガノイドを作製する。作製したオルガノイドを用いて、HuNoV感染実験を行い、ウイルス増殖が有意に上昇する遺伝子を選別する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染症対策として緊急事態宣言が発令された際、所の方針に従うべく研究業務を停止した期間があり、当初予定していた研究を実施できなかったこと、およびコロナ禍により参加予定だった国内学会が中止となったため、次年度使用額が生じた。今後遺伝子ノックアウト細胞を含む複数の腸管オルガノイドを培養する予定であるため、次年度使用額は、腸管オルガノイド培養に必要な試薬（培地、成長因子など）に充てる。