• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2020 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of retrovirus reverse transcription mechanism regulated by integrase.

Research Project

Project/Area Number 20K07525
Research InstitutionTokyo Medical and Dental University

Principal Investigator

増田 貴夫  東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (80219336)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
KeywordsHIV / 逆転写酵素 / インテグラーゼ / 蛋白質 / 核酸 / 酵素 / レトロウイルス / ゲノム
Outline of Annual Research Achievements

1) rRTINの発現系の構築: pET47bRTINをRosetta(DE3)大腸菌株に導入し、0.1mM IPTG添加後18℃で20時間の培養により、可溶性分画からのrRTINの回収率が最大となり、本研究での至適条件として用いた。可溶性分画に抽出されたrRTINを Ni-agaroseカラム・陽イオン交換カラム等によりrRTINを精製した。精製rRTIN の分子量~98 kDa (p98)は、抗RT抗体と抗IN抗体に反応することを確認した。また、HIV-1プロテアーゼ処理により、66 kDa(p66)と51 kDa(p51)のRT産物および32kDa(p32)のIN産物の生成を確認した。以上より、精製された98 kDaのタンパク質(p98)は、RTとINが融合したタンパク質(rRTIN)であることが確認された。
2) rRTINの逆転写酵素活性:rRTINの逆転写酵素活性を無細胞逆転写アッセイ系{Huang, 2019 #32;Masuda, 2015 #2}により評価した。RTは、三つの酵素活性:RNA依存性DNAポリメラーゼ (RDDP)、RNaseH、DNA依存性DNAポリメラーゼ (DDDP)活性をを確認した。可溶性分画より精製されたRT-IN蛋白質を無細胞HIV逆転写アッセイ系(Masuda et al.,Sci. Rep. 2015)により機能評価したところ、rRTINはRTの三つの酵素活性;RNA依存性DNAポリメラーゼ活性(RDDP), RNase H活性, DNA依存性DNAポリメラーゼ活性(DDDP)を高く保持している事を確認した。rRT(p66)との比較解析より、IN融合によるRDDP活性の上昇効果を確認した。本結果は、INが、RTIN融合蛋白を介して逆転写反応の促進に直接関与し、RTとIN融合状態であることの酵素的優位性を示唆する結果と考えられる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムRNAの逆転写過程におけるインテグラーゼ の機能解明に向け、HIV転写酵素(RT)とインテグラーゼ(IN)の融合蛋白質のリコンビナント蛋白質(rRTIN) の調整に着手し、精製度が不十分ではあるが、rRTIN蛋白質の大腸菌内での至適発現誘導と可溶化条件を決定し、不溶性および可溶性分画よりrRTINの部分精製産物を得た。不溶性分画からは機能を保持した蛋白質を精製することはできなかったが、可溶性分画より高い逆転写機能を保持したrRTINの部分精製産物を得た。本研究成果は、RTとの融合蛋白質を介したINの新たな機能解明に向けた基礎研究基盤を確立できた。以上より、研究計画は概ね順調に進展しているものと考える。

Strategy for Future Research Activity

Ni-アフィニティカラムおよび陽イオン交換カラムによる部分精製後、さらにゲル濾過蛋白質精製系を確立して、rRTIN蛋白質の精製純度を高める。これにより、RTIN蛋白質の基質となるウイルスRNAやdNTPへの親和性など生化学的特性を詳細に調べ、IN融合によるRT活性促進への具体的分子機構を探る。INの逆転写過程での未知機能に必須なアミノ酸残基 (Tyr15およびその周辺)の点変異を有するRTIN蛋白質も同様に調整し、比較解析する。これにより、本アッセイ系で得られたRT-IN蛋白質の特性とウイルス複製レベルでの影響との機能相関性が明らかとなり、INの逆転写過程での役割に関する分子機構の解明を目指す。

Causes of Carryover

新型コロナ感染症による外出自粛規制(約3ヶ月間)の為、一部の計画遂行が遅れた為。

  • Research Products

    (3 results)

All 2021 2020

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] Short‐term cultured autologous peripheral blood mononuclear cells as a potential immunogen to activate Tax‐specific CTL response in adult T‐cell leukemia patients2021

    • Author(s)
      Ishizawa Miku、Ganbaatar Undrakh、Hasegawa Atsuhiko、Takatsuka Natsuko、Kondo Nobuyo、Yoneda Takeru、Katagiri Kuniko、Masuda Takao、Utsunomiya Atae、Kannagi Mari
    • Journal Title

      Cancer Science

      Volume: 112 Pages: 1161~1172

    • DOI

      10.1111/cas.14800

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] HIV-1ゲノムRNAの5'末端の違いが構造と機能に与える影響2020

    • Author(s)
      大林カミーユ美智子,篠原陽子,増田貴夫,河合剛太
    • Organizer
      第43回 日本分子生物学会
  • [Presentation] HIV-1 RNAの5’末端塩基修飾による逆転写反応制御機構の解明2020

    • Author(s)
      増田貴夫、黄渝倫、阿部佑哉、長谷川温彦、河合剛太、神奈木真理
    • Organizer
      第34回日本エイズ学会学術集会・総会

URL: 

Published: 2021-12-27  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi