新規接着斑構成因子 FAP1 依存的ながん転移メカニズムの解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07564
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 辻岡 政経 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, プロジェクト講師 (60442985)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: FAP1 / 接着斑 / Nrf2 / DNA損傷ストレス / がん

Outline of Annual Research Achievements

申請者は、新たに発見した接着斑構成タンパク質FAP1が、がんの生着や播種に深く関わっていることを見出した。本研究では、FAP1の機能解明により、がんの悪性化機構を明らかにすること、このメカニズムを標的とする抗がん剤を開発すること、を目標としている。前年度までに、以下のことを明らかにした。(1)DNA損傷ストレスによって、FAP1の発現が強く誘導される、(2)FAP1 の発現が検出される腫瘍塊では、DNA 損傷マーカーも発現している、(3)DNA損傷ストレス下で、FAP1欠損細胞は、正常細胞よりも基質から剥がれ易い、(4)転写因子NF-E2の構成因子Nrf2が、FAP1発現に必要である。これらの結果から、生体内の腫瘍塊中の細胞では、DNA損傷ストレスによってFAP1の発現が誘導され、これによる細胞接着の維持が、がんの生着・転移を促進していると予想した。
当該年度は、FAP1が構成因子として接着斑に加わると、細胞接着を増強することを見出した。また、in vitroでの腫瘍塊形成実験により、FAP1を欠損するがん細胞は、いったん腫瘍塊を形成するものの、それを維持できず、腫瘍塊が崩壊することを観察した。したがって、DNA損傷ストレスにより発現したFAP1が、細胞接着を増強し、これが腫瘍塊の成長、がんの進展に重要であると考えた。また、ヒトがん検体を用いてFAP1遺伝子の発現を調べたところ、原発巣の組織に比べて、転移組織において、高頻度にFAP1の発現が検出され、FAP1とがん転移の関連が、ヒトにおいても示唆された。また、X線照射によりマウスにDNAダメージを与えると、胃の粘膜組織においてFAP1の発現上昇が検出され、FAP1欠損マウスでは、胃の上皮組織に強いダメージが観察された。すなわち、DNA損傷ダメージに対するFAP1の組織防御機能を明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度は、DNA損傷ストレス下で、FAP1欠損細胞が基質から剥がれ易いことを見出した。当該年度は、FAP1を人為的に発現させた細胞を用いて、FAP1の機能を解析した。FAP1を構成因子とする接着斑は、通常の接着斑に比べて、安定で寿命が長かった。このため、FAP1発現細胞では、通常細胞に比べて、接着斑の数とサイズが増していた。接着力が増大していることも、原子間力顕微鏡を用いた測定により確認した。したがって、FAP1の接着斑における機能を明らかにし、DNA損傷ストレスを受けた細胞は、接着性が高まることを見出した。
また、マウスへのがん細胞移植実験において、FAP1の欠損により、がんの生着・播種が抑制されることを前年度までに見出していた。当該年度は、in vitroでの腫瘍塊形成において、FAP1欠損がん細胞は、腫瘍塊をいったん形成するものの、それを維持できず、腫瘍塊が崩壊することを見出した。すなわち、FAP1は、腫瘍塊の成長に重要であった。さらに、ヒトのがん検体では、原発巣組織に比べて、転移組織で高頻度にFAP1の発現が検出され、ヒトにおいても、FAP1とがんの進展の関係が示唆された。
前年度に、FAP1欠損マウスを作製したが、通常の飼育環境では、顕著な表現型は見られなかった。そこで、培養細胞での結果を考慮し、当該年度は、X線を照射してDNA損傷ストレスを与えたマウスを解析した。すると、正常マウスの胃の粘膜組織において、X線照射によるFAP1の発現誘導が確認された。さらに、FAP1欠損マウスでは、胃の上皮組織に強いダメージが観察された。すなわち、FAP1は、DAN損傷ストレスから正常組織を防御する機能があることが分かった。
以上から、当該年度は、FAP1の接着斑における機能、それによるがん進展に対する関与、生理的機能を明らかにすることができ、一定の研究成果が得られた。

Strategy for Future Research Activity

当該年度は、FAP1が接着斑に加わると、通常の接着斑より安定となり、寿命が長くなることを明らかにした。次年度は、この分子メカニズムを明らかにする。抗FAP1抗体を用いて免疫沈降を行い、FAP1の結合分子を同定する。同定した分子の機能とFAP1との関係を解析する。また、FAP1の有無による接着斑の機能の差異をさらに調べるため、既存の方法で接着斑を抽出して、構成因子を比較する。また、接着斑の下流のシグナル分子の活性化状態を比較する。顕著な違いが見られたものについて、さらに解析を進める。
当該年度は、FAP1欠損がん細胞では、形成した腫瘍塊の維持ができないことを、in vitroの系において見出した。これが、in vivoでのがん進展抑制の要因であると考え、次年度は、この系を用いて、腫瘍塊の成長におけるFAP1の機能を解明する。FAP1の関与する接着が腫瘍塊の維持、成長に必要であると予想しているので、まず、DNAダメージマーカーとFAP1発現の時空間的パターン、また、その他の接着斑構成タンパク質や接着の基質タンパク質の発現パターンも同時に調べ、FAP1欠損細胞による腫瘍塊では、どこに異常があるのかを検討する。この系で、FAP1の関与する腫瘍塊成長のメカニズムを明らかにし、マウスへのがん移植の際のがんの進展においても、同様のメカニズムがあるか確認する。
現在、FAP1の関与するがん進行メカニズムを標的とした抗がん剤を開発するため、DNA損傷ストレス下でFAP1の発現を抑制する化合物を、約２万種の低分子化合物ライブラリーからスクリーニングしている。次年度は、得られた化合物を、複数種類の転移性がん細胞を移植したマウスに投与し、がん転移の改善効果を評価する。既に発現抑制効果を確認したNrf2阻害剤においても同様の実験を行う。

Causes of Carryover

当該年度は、国の緊急事態宣言、まん延防止等重点措置の期間が約8ヶ月を占めた。この期間中、大学においても、新たな実験計画の延期やマウス飼育数の抑制などの要請がなされ、研究活動が制限されていた。そのため、実験のための支出が一定程度抑制された。また、前年度の緊急事態宣言の際に、大学からの指示により、凍結卵として保存していたマウスの系統を、再び個体復元するために確保していた費用も予定より抑えられた。
繰り越した費用は、上記の理由で遅れた計画を補完し、研究計画通りのマウス実験を行う環境を整えるための費用にあてる。尚、研究に遅滞が生じている部分は、既にほぼ明らかにしたことをさらに確認するための実験等であり、全体の研究進捗自体は概ね順調であると考えている。