RNF168が制御する新たなRNA代謝経路とそれが寄与するがん増殖の分子機構

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07578
• Research Institution: Japanese Foundation for Cancer Research
• Principal Investigator: 渡邉 健司 公益財団法人がん研究会, がん研究所 がん生物部, 研究員 (80404333)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: RNF168 / ユビキチン化 / スプライシング / DNA損傷

Outline of Annual Research Achievements

DNA二重鎖切断（DSB）のごく近傍のクロマチン上でヒストンH2AXがユビキチン化されることが知られている。その際、DSBにBRCA1、RNF168、RAD18及びRNF8に代表されるユビキチンライゲースがDSBに応答しDSB周囲のクロマチンにリクルートされることが知られている。これらのE3ライゲースがクロマチン上でそれぞれ対応する基質をユビキチン化することにより細胞内では細胞周期の一時的な停止やDSBの修復反応が促進されることが知られている。先行研究においてRNF8やRNF168が細胞内で生じたDSBに応答し同部にリクルートされ、RNF8及びRNF168によるヒストンのユビキチン化反応を介して切断された遺伝子上で転写をまさに行っているRNA polymeraseIIの転写を抑制する機構が存在することが知られている。しかしながら、RNF8及びRNF168の基質はDNAに2重鎖切断応答におけるヒストンH2AX以外にほとんど報告されていない。細胞内でDNA損傷が生じた所謂、細胞にとって緊急時以外において、RNF8及びRNF168が直接的に転写機構やRNA代謝経路を恒常的に制御していることを示唆する報告はない。RNF168ノックアウトマウスを用いた先行研究より、RNF168はp53と協調し遺伝子の不安定性化を抑制しがん抑制遺伝子としての機能が知られている。本研究において、このDNA2重鎖切断応答に関与する一群のユビキチンライゲースがRNA代謝に関与するタンパクのユビキチン化を介してRNA代謝経路を制御している機構と、がんの増殖進展への寄与を、主にスプライシング機構および核小体機能に着目し解明する。従来RNF168はDNA損傷修復に関わることのみが知られていたが、本研究では新たに、がんにおいてはRNA代謝を制御する機能も持つことを明らかにする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

以前に行っていた予備実験の結果、RNF168の基質と考えられる候補タンパクの中から、すでにRNA転写およびスプライシング機構に関与することが報告されているタンパクを選択し実際にそれらのタンパクが細胞内でRNF168依存的にユビキチン化されるかについて検討した。またその基質のユビキチン化がDNA二重鎖切断（DSB）やRNAの転写阻害を含めた種々の細胞ストレスに依存して増加するかについて検討した。それぞれの基質候補タンパクについて、タグをつけた状態で恒常的に発現する安定株をU2OS細胞を用いて樹立した。これらの細胞を用いてRNF168の基質候補タンパクのユビキチン化を確認したところ、基質のポリユビキチン化がDSB誘導やストレスを細胞に与える以前から認められた。更にはこのストレスを与える以前のユビキチン化はRNF168依存的であることが分かった。このことはRNF168が細胞ストレスやDSBが生じる以前より、恒常的に転写機構をユビキチン化し制御している可能性があることを示唆している。

Strategy for Future Research Activity

RNF168結合タンパク質でその基質候補タンパク群のなかで、先行研究によって転写やスプライシングに関与することが明らかにされているタンパクに着目し実験を行う予定である。具体的には、基質候補タンパクをノックダウンした際に転写やスプライシング効率の変化をがん細胞を用いた実験系においてEU取り込みやalternative splice formの量的な変化をread outとして検出する。その基質候補タンパクのユビキチン化されるリジン残基を特定することにより、そのリジン残基に変異を導入した変異体をがん細胞に発現する安定細胞株の樹立を試みる。その安定細胞株をもちいて転写やスプライシング効率の変化を確認する。その際、DNA損傷を与えた場合と通常状態での転写やスプライシング効率への影響を比較する。RNF168は核小体内にも存在することより、核小体機能におけるこれら基質のユビキチン化を介した機能制御についても検討する予定である。核小体機能阻害における核小体ストレスは細胞内でp53の蓄積を誘導し、細胞増殖を抑制することが知られており、所謂リボゾーム生合成過程におけるRNF168の関与を明らかにしていく予定である。今後の目標としては、DNA2重鎖切断に関与するユビキチンライゲースが転写機構を制御しがん細胞がその旺盛な増殖ゆえに恒常的に生じるストレスを回避しその増殖を促進している可能性について明らかにしていく。

Research Products

• [Journal Article] Ribosomal protein L5 facilitates rDNA-bundled condensate and nucleolar assembly (2022)
  • Author(s): Matsumori Haruka、Watanabe Kenji、Tachiwana Hiroaki、Fujita Tomoko、Ito Yuma、Tokunaga Makio、Sakata-Sogawa Kumiko、Osakada Hiroko、Haraguchi Tokuko、Awazu Akinori、Ochiai Hiroshi、Sakata Yuka、Ochiai Koji、Toki Tsutomu、Ito Etsuro、Goldberg Ilya G、Tokunaga Kazuaki、Nakao Mitsuyoshi、Saitoh Noriko
  • Journal Title: Life Science Alliance Volume: 5 Pages: e202101045
  • DOI: 10.26508/lsa.202101045
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research