2020 Fiscal Year Research-status Report

Analysis of mechanisms which regulate stemness in stomach tumor and searching of new treatment.

Research Project

Project/Area Number	20K07586
Research Institution	Kanazawa University
Principal Investigator	村上和弘金沢大学, がん進展制御研究所, 助教 (60455368)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	胃がん / 幹細胞
Outline of Annual Research Achievements	我々の体は、細胞外シグナルや細胞内分子機構によって適切な時期に規則正しく発生する。この発生過程において必須な役割を担っているのが「自己複製能」と「異なる細胞への分化能」を持つ「幹細胞」である。この幹細胞は、発生初期のみならず成体各組織にも存在し、組織の恒常性の維持および傷害からの修復に必要不可欠な役割を担っている。一方、近年がん組織にも幹細胞様細胞が存在することが示されつつある。がん幹細胞様細胞は放射線耐性・薬剤耐性を持ちつつ、がんの転移・再発を引き起こすことから、がん幹細胞様細胞に対する効果的な治療法を確立することは喫緊の課題である。これまでに申請者らはマウス・ヒトの胃線の底部にLgr5遺伝子を発現する胃正常組織幹細胞を同定した。さらなる解析により、一群の転写因子がこれら細胞で幹細胞性を制御していることが明らかになりつつある。驚くべきことに、それらの転写因子は胃がん細胞においても幹細胞様性質を導くことも明らかになりつつある。一連の研究結果は、正常幹細胞の生存に必須な分子機構が、がん幹細胞様細胞において利用されていることを示唆するが、その詳細は未だ明らかではない。本研究においては、マウスとヒトの胃正常・がんオルガノイドの生体外・生体内の解析を通して正常幹細胞とがん幹細胞様細胞を詳細に比較解析し、がん幹細胞様細胞のみで特徴的な使われ方をしている分子機構を明らかにする。その知識の上で新規薬剤の探索を行い、従来とは異なる角度からがん幹細胞様細胞に対する治療法を確立することを目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究項目1; Lgr5陽性細胞をEGFPの発現により可視化およびジフテリアトキシン(DT)の投与により選択的に除去できるLgr5DTR-EGFPマウスと炎症マウスモデル(C2mE)、悪性度の高い胃がんを発症する胃がんマウスモデル(Apc KO/ KrasG12D/ p53 KO)の交配を行い、新規胃がんマウスモデルを樹立した。これらのマウスで生じた胃がんにおいて、Lgr5陽性がん細胞を除去することで、胃がんの進行が抑制された。このことより、大腸がんと同様に胃がんおいてもLgr5陽性がん細胞が幹細胞性を持っていることが示唆された。一方で、前述のマウスから胃がんオルガノイドを樹立し、分子生物学的解析を通してLgr5陽性がん幹細胞様細胞の特性を理解することを試みた。研究項目2; マウス正常および胃がんオルガノイドで、転写因子Sox9を時期特異的に過剰発現およびノックアウトした結果、Sox9の発現がLgr5陽性の正常胃組織幹細胞および胃がん幹細胞様細胞の幹細胞性維持に必須である可能性が示唆された。これらのオルガノイドを免疫不全マウスの胃へ同所移植することで、生体内でLgr5陽性胃がん幹細胞様細胞におけるSox9の役割を解析した。研究項目3; システム生物学者 Pinzhao Hu博士と共同で立ち上げたAIを用いた画像解析技術および効果的な薬剤の検索技術を胃がんオルガノイドに適用し、薬剤スクリーニングの基盤を構築した。
Strategy for Future Research Activity	研究項目1; マウス胃がんオルガノイドを用いて得られた知見をヒトオルガノイドで検証すべく、CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いて、ヒト胃がんオルガノイドのLGR5遺伝子座にEGFPおよび選択的にアポトーシスを誘導できるiCaspase9遺伝子を挿入する。これらのオルガノイドを免疫不全マウスの胃へ同所移植し、LGR5陽性細胞を可視化および選択的に除去することで、ヒトLGR5陽性胃がん細胞が幹細胞様性質を示すかどうかを検証する。研究項目2; マウス・ヒト胃がんオルガノイドを用いて、生体外・生体内で胃がん幹細胞様細胞に特徴的なSox9の下流分子機構を分子生物学的な解析を通して明らかにする。研究項目3; 胃がん幹細胞様細胞を標的とする化合物候補を胃がんオルガノイドの培養液中に添加し、形態・増殖、Lgr5遺伝子の発現状態を指標に画像解析を行い、薬剤候補の絞り込みを行う。さらに、ヒト胃がんオルガノイドを免疫不全マウスの胃へ同所移植し、生体内での薬剤の効果を検証する。