2020 Fiscal Year Research-status Report
発がんにおけるDNA損傷・修復ダイナミクスの実像解明
| Project/Area Number |
20K07588
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
赤塚 慎也 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (40437223)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
豊國 伸哉 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (90252460)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 発がん / ゲノム解析 / 次世代シークエンシング / DNA傷害 / DNA修復 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
酸化ストレス等によるゲノムDNAの損傷は、発がんの原因になると考えられている。したがって、がんの発生経路を詳細に解析するためには、発がんの過程にある細胞のゲノム内におけるDNA損傷の分布動態を知ることが重要となる。近年、DNAのメチル化やヒストン修飾などのエピゲノム情報のプロファイリングについては、次世代シークエンサーを用いた方法によりハイスループット化、高解像度化が図られている。しかしながら、ゲノム部位間での損傷頻度の違いを網羅的に評価するための技術は未だ十分に確立されていない。本研究では、損傷DNAに対する免疫沈降産物の網羅的解析を次世代シークエンサーの新たなアプリケーションとして確立し、発がん過程におけるDNA損傷のゲノム分布動態を解明する。さらに、その際の変異の発生頻度を評価することにより、DNA損傷分布変化の発がんにおける意義を明らかにする。
本研究課題では、鉄ニトリロ三酢酸誘発げっ歯類発がんモデルを用い、その標的臓器となる腎臓の組織細胞より抽出したゲノムDNAについて抗8-オキソグアニン抗体を用いて免疫沈降を実施し、酸化的DNA損傷のゲノム内分布解析を行う。
正常時および鉄ニトリロ三酢酸腹腔内投与後3時間（酸化ストレス亢進時）のマウス腎組織を採取し、ゲノムDNAを抽出した。8-オキソグアニンに対する抗体を使用してDNA免疫沈降を施行した。次世代シークエンサーによる分布解析を実施する前に、得られた免疫沈降産物を、リアルタイムPCRを用いて評価した。リアルタイムPCRによる結果を以前のアレイCGHによる結果と比較し、それぞれの方法でのバイアスの評価を行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
全体として、当年度の新型コロナ感染症流行への対応により、教育その他の業務量が増えてしまい、研究に割ける時間が当初より少なくなってしまったため、多少なりとも課題の推進に影響した。次年度以降はその他業務の効率化とともに時間配分を抑えることにより、進捗状況を回復する予定。
また、研究内容に関連しては、関連研究の新しい報告に対応して実験原理の再評価と見直しを行ったため、次世代シークエンサー解析の前にその工程に当てる時間が必要となった。しかし、実験結果の品質向上のために価値のある工程であった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
実験原理の再評価の成果を踏まえて、次世代シークエンサーによる解析方法を確立する。これまでのCGH用マイクロアレイを用いた解析の結果と比較検討しつつ、次世代シークエンサー解析による実験プロトコルおよびデータ解析パイプラインの最適化を行う。次世代シークエンシングのプラットフォームとしては、米国illumina社のHiSeqシステムを採用する。本研究においては、1サンプルあたりのシークエンスリード数は2,000万リードを目途としてシークエンスを実施する。方法について十分な妥当性を得たうえで、着実に当初の計画を遂行し、生物学的・医学的価値の高い結果を収集する。
|
| Causes of Carryover |
当年度の新型コロナ感染症流行への対応のための業務増加が課題推進に影響したこと、関連研究の新しい報告に対応して実験原理の再評価と見直しの工程が加わったことにより、次世代シークエンサー実験が次年度への持ち越しとなった。当初、次世代シークエンサー実験の委託料が予算の大きな割合を占めていたため、今回の次年度繰り越し金額が発生した。次年度以降、研究期間内に同実験のために使用する予定。
|
