2021 Fiscal Year Research-status Report
発がんにおけるDNA損傷・修復ダイナミクスの実像解明
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20K07588
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
赤塚 慎也 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (40437223)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
豊國 伸哉 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (90252460)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 発がん / ゲノム解析 / 次世代シークエンシング / DNA傷害 / DNA修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酸化ストレス等によるゲノムDNAの損傷は、発がんの原因になると考えられている。したがって、がんの発生経路を詳細に解析するためには、発がんの過程にある細胞のゲノム内におけるDNA損傷の分布動態を知ることが重要となる。本研究では、損傷DNAに対する免疫沈降産物の網羅的解析を次世代シークエンサーの新たなアプリケーションとして確立し、発がん過程におけるDNA損傷のゲノム分布動態を解明する。さらに、その際の変異の発生頻度を評価することにより、DNA損傷分布変化の発がんにおける意義を明らかにする。本研究課題では、鉄ニトリロ三酢酸誘発げっ歯類発がんモデルを用い、その標的臓器となる腎臓の組織細胞より抽出したゲノムDNAについて抗8-オキソグアニン抗体を用いて免疫沈降を実施し、酸化的DNA損傷のゲノム内分布解析を行う。さらに、鉄ニトリロ三酢酸による発がん刺激を持続的に受けた後の腎組織についてゲノム変異解析を実施し、DNA損傷分布と変異発生頻度の関係を分析する。
動物実験として、野生型マウスおよびOGG1欠損マウスに対して、2週間にわたり鉄ニトリロ三酢酸の腹腔内投与を反復的に実施した。OGG1は、ゲノム中に生じた8-オキソグアニンの修復に必須の酵素である。正常時および鉄ニトリロ三酢酸2週間投与後のマウス腎組織を採取してゲノムDNAを抽出した。調査するゲノム部位に相当するPCRプライマーを設計し、高忠実度ポリメラーゼを用いてアンプリコンを調整した。アンプリコサンプルを次世代シークエンシングに供し、変異解析を行った。変異発生頻度および変異スペクトラムの分析を行い、当該ゲノム部位の8-オキソグアニン蓄積傾向との関係を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
特に前年度において、新型コロナ感染症パンデミックの到来により、教育活動よび研究室活動の新たな形式での再立ち上げのための業務負荷が高まり、課題の推進に影響を受けた。当該年度においては、パンデミックの影響は継続して受けつつも、その他業務の効率化とともに時間配分を抑えることにより、進捗状況の回復に努めた。
また、研究内容に関連しては、最近の報告から実現方法について懸念が生じた変異解析について優先して実施した。そのため、免疫沈降によるDNA損傷分布の解析の次世代シークエング対応に遅れが生じることとなった。しかし、課題項目全体の見通しを明るくできたため、計画完遂に向けて遠回りとはなっていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験原理の再評価の成果を踏まえて、次世代シークエンサーによる解析方法を確立し、各種の生物学的および病理学的条件におけるDNA損傷分布データを出力していく。その過程で、データ解析パイプラインのさらなる最適化を行う。次世代シークエンシングのプラットフォームとしては、米国illumina社のHiSeqシステムおよびMGI社のDNMSEQシステムを使用する。DNA損傷分布解析においては、1サンプルあたりのシークエンスリード数は2,000万リード以上を目途としてシークエンスを実施する。方法について十分な妥当性を得たうえで、迅速に当初の計画を遂行し、生物学的・医学的価値の高い結果を収集する。
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| Causes of Carryover |
特に前年度において、新型コロナ感染症パンデミックの到来により、教育活動よび研究室活動の新たな形式での再立ち上げのための業務負荷が高まり、課題の推進に影響を受けた。研究内容に関連しては、最近の報告から実現方法について懸念が生じた変異解析について優先して実施したため、免疫沈降によるDNA損傷分布の解析の次世代シークエング対応に遅れが生じることとなった。それらのことにより、助成金の使用額が当初予定より少なくなった。当該年度以降は、パンデミックの影響は継続して受けつつも、その他業務の効率化とともに時間配分を抑えることにより、計画推進の回復に努めており、進捗状況は改善している。課題項目全体の見通しは明るくなっており、当初予定の助成金を使用したうえで、計画を完了する予定である。
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