Targeting epigenetic regulators for impairment of DNA repair as a novel cancer therapy

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07607
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 菊地 英毅 北海道大学, 大学病院, 講師 (60463741)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 菊地 順子 北海道大学, 大学病院, 特任助教 (40739637)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: DNA損傷修復 / DNA２本鎖切断 / NHEJ

Outline of Annual Research Achievements

当初予定していたDMAPTを用いてNHEJに対する影響を検討したが、過去に報告されている程度にはNHEJを抑制しなかった。これは細胞株や実験環境の違いが原因として考えられた。ヒストンH4K20メチル化酵素SUV4-20H1/H2阻害剤であるA-196はNHEJが特異的に抑制されることが報告されており、我々はこの薬剤とNHEJレポータープラスミドを用いたフローサイトメトリー法を用いて、肺癌細胞株のNHEJを抑制できるかどうか、このことにより肺癌に細胞死を誘導できるかどうかを測定した。結果、A-196は5-10uM程度の濃度でNHEJレポーターを遺伝子導入したH1299細胞および293T細胞にて有意にNHEJ活性を低下させた。しかしA-196の50%阻害濃度（IC50）は15uM以上であり、NHEJ活性の低下のみでは細胞死を誘導しないことが判明した。
次にこのNHEJ活性低下を応用したがん治療法開発のため、各種殺細胞性抗癌剤との併用実験を行い、併用効果をCompusyn softwareを用いた併用係数(combination index: CI)にて評価した。NHEJの機序を考えるとところ、H1299細胞に対してパクリタキセル（PTX）およびドセタキセル（DOC）はNHEJ阻害薬との相乗効果を示した。しかし、A549細胞、H1975細胞、H520細胞では併用効果を示さなかった。またS期でのDNA切断を引き起こすペメトレキセド（PEM）は全ての細胞において併用効果を示さなかった。H1299細胞に対するNHEJ阻害とパクリタキセルの殺細胞性効果の作用機序を同定するために、アネキシンⅤとプロピジウムイオダイド(PI)の二重染色を用いたフローサイトメトリー法およびcPARPを標的としたウェスタンブロットを行い、NHEJ阻害によりアポトーシスが増強されることを同定した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初予定していたDMAPTを用いてNHEJに対する影響を検討したが、過去に報告されている程度にはNHEJを抑制しなかった。これは細胞株や実験環境の違いが原因として考えられた。そのため薬剤を変更し、ヒストンH4K20メチル化酵素SUV4-20H1/H2阻害剤であるA-196を用いて研究を継続することとした。
また当初我々は、NHEJの抑制による抗腫瘍効果はパクリタキセル、ビノレルビンといった殺細胞性抗癌剤はM-G1期の細胞のDNAを傷害するため、特にNHEJ抑制がその効果的だと考えた。しかし、予想に反して、NHEJ阻害はH1299細胞でパクリタキセルと相乗効果を認めるものの、その他の細胞では相乗効果はみられなかった。

Strategy for Future Research Activity

当初NHEJの抑制による抗腫瘍効果はパクリタキセル、ビノレルビンといった殺細胞性抗癌剤はM-G1期の細胞のDNAを傷害
するため、特にNHEJ抑制がその効果的だと考えた。しかし、予想に反して、NHEJ阻害はH1299細胞でパクリタキセルと相乗効果を認めるものの、その他の細胞では相乗効果はみられなかった。今後NHEJ抑制を臨床応用して新たな治療法を検討するために、NHEJ阻害が有効となる細胞を同定するマーカーを発見したいと考えている。これまでの検討では、NHEJ抑制が効果がある細胞は、効果がない細胞と比較してパクリタキセルによるM期増強効果が弱い可能性が示唆されており、これにはmitotic slippageが関与しているのではないかと考えている。このことについてさらに検討を追加する予定である。

Causes of Carryover

COVID-19流行のため、予定していた学会に参加できず、旅費がかからなかった。またCOVID-19流行のため研究室が使用できない時期が約2カ月間あった。昨年度行う予定だったができなかった細胞実験を本年度中に行う予定であり、昨年度使用できなかった額は本年度に試薬および細胞実験用備品を購入するために使用する予定である。