2020 Fiscal Year Research-status Report
Survival mechanism of breast cancer cells in the bone microenvironment at the latent stage of bone metastasis
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20K07619
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
二口 充 山形大学, 医学部, 教授 (60275120)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 骨微小環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
欧米諸国の女性に罹患率の高い乳がんは、原発巣治療後、数年から十数年後に脊椎や骨盤などに骨転移巣が高率に発生する。我々は、骨転移巣が顕在化するまでの間、骨微小環境においてがん細胞が生存すると仮説を立てた。本研究は、潜在期の骨微小環境において乳がん細胞が生存するメカニズムの解明を目的とする。独自に開発した動物モデルを用いて、潜在期の骨微小環境において特異的に発現する遺伝子の同定および機能解析を行い、骨微小環境に潜在するがん細胞が顕在化しないことを確認する。本研究の成果に基づき、骨微小環境で潜在する乳がんの顕在化機構が明らかとなり、顕在化する前に骨微小環境に潜むがん細胞（顕在化前の微小骨転移）を標的とした治療法が確立でき、原発巣治療後に発生する骨転移を防ぐ治療法を創造することができる。
今年度は、BalbCマウス由来の乳がん細胞株であるCL66M2を用いた。このCL66M2を12匹のBalbC雌マウスの皮下および頭蓋骨直上にそれぞれ1.0x106個移植した。著しい腫瘍塊の形成が認められる移植後30日では（顕在期）、増殖した腫瘍と頭蓋骨が接する部分では、破骨細胞が誘導され強い溶骨性変化を伴い腫瘍細胞が増殖する組織像を呈し、ヒトの乳がん骨転移巣と同じ組織像が観察できた(骨微小環境)。皮下に移植した領域においては、がん細胞が脈管誘導を伴い増殖する像が観察できた（皮下微小環境）。一方肉眼的に腫瘍塊の形成がほとんど認められない移植後7日（潜在期）では、骨の直上あるいは皮下組織に薄い線維性瘢痕組織中に、わずかながん細胞が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、潜在期の骨微小環境において特異的に発現する遺伝子群の同定する目的で、サンプルの準備が完了したところで、概ね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
潜在期の骨微小環境において特異的に発現する遺伝子群の同定する目的で、潜在期の骨微小環境においてがん細胞の生存に関与する因子は、骨微小環境由来の潜在期のサンプルでのみ発現すると考えられる。従ってEx.1で得られたサンプルを用いて東レmicroarrayにより遺伝子発現を検索する。潜／骨でのみ発現上昇／低下がある遺伝子を、微小環境において、潜在期のがん細胞の生存に関与するに遺伝子群とする。
さらには、潜在期の骨微小環境でのがん幹細胞に特異的な遺伝子の同定する目的で、in vivoでの組織を用いた検索では特異的な因子を絞り込めない可能性がある。そこで我々は微小環境におけるがん幹細胞を単離する方法を用いて、がん細胞に発現を示す遺伝子を検索することで、候補遺伝子を絞り込む。Ex.1と同じ方法でそれぞれの微小環境から組織片を作成する。これらの組織片をコラゲナーゼ処理してsingle cellを作成し、培養プレート上に30分培養した後非接着細胞を回収する。3D culture (96 well) で72時間培養しspheroidを形成したがん細胞をがん幹細胞として回収する（潜／骨／3D, 顕／骨／3D）。同様に通常の方法で96well plateで72時間培養したがん細胞を対照として回収する（潜／骨／2D, 顕／骨／2D）。それぞれの細胞からRNAを抽出し、東レmicroarrayにより遺伝子発現を検索する。潜／骨／3Dでのみ発現上昇／低下がある遺伝子を、潜在期の骨微小環境でのがん幹細胞に特異的な遺伝子群とする。Ex.1でおよびEx.2で共通した因子を微小環境において、潜在期のがん細胞の生存に関与する遺伝子とする。
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