CD19発現型AdVとCD19 CAR-T細胞を組み合わせた遺伝子細胞治療戦略

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07679
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 吉田 秀樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10643546)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柳生 茂希 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 学内講師 (10572547) ; 菊地 顕 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (40453104)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 腫瘍溶解性アデノウイルス / CAR-T / CD19 / 横紋筋肉腫

Outline of Annual Research Achievements

【背景】近年血液腫瘍においてCD19を標的とするキメラ抗原受容体T（CAR-T）細胞療法の高い奏効率が報告されているが、固形腫瘍に対して十分な臨床効果を示した報告は未だない。本研究では腫瘍溶解性アデノウイルス（OAd）を遺伝子改変する技術と、CAR-T細胞療法開発技術を用いて、多彩な固形腫瘍に対して既存のCD19 CAR-T細胞による治療を可能とすることを目的とする。
【方法】
①CD19安定発現横紋筋肉腫細胞株（CD19-Rh30）の作製。②CD19-Rh30とCD19 CAR-Tの共培養。③CD19発現型-RMS特異的OAd(CD19-OAd)の開発。④CD19-OAdによる、CD19 CAR-Tの抗腫瘍効果の検証
【成果】
①CD19-RMSの作製:pcDNA3.1発現ベクターを用いてCD19を発現するRMS細胞株（Rh30）を作製した。またpuromycinにてセレクションを行い、フローサイトメトリーにより安定して発現していること確認した。②CD19-Rh30とCD19 CAR-Tの共培養:CD19-Rh30および、野生型のRh30とCD19 CAR-Tを共培養し、real time analyzerでRh30に対する抗腫瘍効果を評価する。現在CAR-T細胞作製におけるエレクトロポレーションの最適化や最も差が顕著となるE:T比などを検証し、系の安定に努めている。③CD19-OAdの開発。MYOGプロモーター制御型OAdをもとに、E1geneの後にCD19をつないだコンストラクトを作製し、ウイルスとしてassemble可能か検証中である。④CD19-OAdによる、CD19 CAR-Tの抗腫瘍効果の検証（現時点で到達していない）。ウイルスが作製次第、CAR-Tとの併用効果をin vitro, in vivoで検証する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本プロジェクトは新型コロナウイルスの影響を受け、やや遅れている。
研究代表者以外にも大学院生や技術研究員がこのプロジェクトの遂行を担っている。複数回にわたる緊急事態宣言の間、大学院生および科学技術員が自由に研究室を利用しにくくなったり、通勤に支障が生じたりした。またウイルスのバックボーンベクターを送ってくれるはずの米国の研究室が数か月ストップしてしまい、特にウイルス作製において遅れることとなった。ただし、既に米国の研究室も再開しており、ウイルスベクターも到着しているため、この遅れを取り戻すべく、全力を尽くす所存である。

Strategy for Future Research Activity

昨年度中にCD19 CAR-Tを当研究室で安定して作成する技術は確立しており、速やかに実験条件を決定していく。ウイルスのバックボーンベクターの到着後、既にウイルス作製に着手している。MYOGプロモーター制御型OAdをもとに、E1geneの後にCD19をつないだコンストラクトを複数作製し、どのコンストラクトがウイルスとしてassemble可能かを検証する。最適なウイルスが決まれば、増殖・精製し、in vitro, in vivo実験につなげる。コロナウイルスの社会に与える影響は読み切れない部分があるものの、プロジェクトを遂行することは十分可能と考える。

Causes of Carryover

ウイルスバックボーンプラスミドの到着の遅れからウイルス作製が遅れた。そのため、2020年度はウイルスの増殖・精製に使用する試薬、消耗品、作成されたウイルスを用いたassay（binding assay, replication assay, cell killing assayなど）を実施することができなかった。assayを実際に行う2021年度以降に有効に資金を使用できるようにするため、「次年度使用額」が生じた。