2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of a diagnostic platform for precision oncology by applying reverse-phase phosphoprotein array to an analysis of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue
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20K07690
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
増田 万里 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員研究員 (70435717)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | がん高精度医療 / 薬剤耐性 / リン酸化タンパク質 / 逆相タンパクアレイ / ホルマリン固定・パラフィン包埋組織（FFPE） |
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| Outline of Annual Research Achievements |
包括的がんゲノムプロファイリング(CGP)によるがんゲノム高精度医療が、がん医療の実臨床に普及してきた。しかしながら、CGPによるがんゲノム高精度医療により適切な治療が見つかり恩恵を受けることができる患者は現状では20％に満たないことが報告されている。多くの分子標的治療薬の標的となるキナーゼや下流シグナルのタンパク質の活性化（リン酸化）を、我々が開発した逆相リン酸化タンパクアレイ（RPPA）法により正確に把握できれば、分子標的治療薬による適切な治療戦略の提示や薬剤に対する初回耐性や治療後の獲得耐性の克服に貢献し、現在のがんゲノム精密医療の更なる改善が期待される。本研究課題では、一般的に病理診断で用いられるホルマリン固定・パラフィン包埋組織（FFPE）を用いた逆相リン酸化タンパクアレイ（FFPE-RPPA）による解析を行う為の技術開発及び改善を進め、今後のがんゲノム高精度医療を補強できる有用な技術基盤にすることを目指している。本年度は昨年度に引き続き、細胞株のペレットよりFFPEブロックを作製し、FFPEサンプルからのタンパク質抽出方法及びFFPE-RPPA法のアレイの作製法について、凍結細胞から得られた抽出液を用いた場合と比較しながら最適化を進め、SOP（Standard Operating Procedures）を作成した。また、RPPAの染色法・シグナル検出法の最適化、適切なコントロールの比較選定、定量解析に適切な標準分子の検討を行った。また、昨年度着手した米国MD Anderson Cancer Center で開発された定量解析のソフトウエアSupercurveのGUIが完成し、これまでの定量法との相関について検証を行った。本GUIの開発によって、Clustering解析・相関解析、2条件での比較解析が容易になり、データ解析に要する時間が大幅に短縮することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和３年度は、FFPEを用いた逆相リン酸化タンパクアレイ（FFPE-RPPA）法の確立を目指し、同じ条件で培養した細胞でFFPE細胞塊と凍結細胞塊を準備しタンパク抽出液を得て、両者の比較によりFFPE-RPPA法の最適化を行った。凍結細胞を用いた解析は既に最適化が終了しており、凍結細胞由来タンパク質によるRPPA定量値と最も高い相関を示すFFPE細胞塊由来タンパク質の抽出条件を検討した。抽出液に含まれるSDSの濃度はタンパク質抽出効率及びアレイ作製に影響を与えるため、SDS濃度の希釈系列を作製し、検討を行った。また、アレイ上にスポットされるタンパク量の標準化を行う為のloading コントロールには１次抗体を除き染色を行ったNegative Ctrl.と１次抗体にtubulin抗体を用いて染色し得られた定量値が高い相関（CC = 0.981）を示しloading コントロールとして適切であることを確認した。更に、最適化された条件で、EGFR変異によりEGFR阻害薬エルロチニブ及びゲフィニチブ（EGFR-TKI）の感受性が異なる肺がん細胞株PC9（EGFR-TKI感受性）とH1975（EGFR-TKI抵抗性）を用いてRPPAを作製し、EGFR下流のシグナル分子のリン酸化タンパク質を定量し、EGFR-TKIに対する感受性及びシグナル活性について検証を行った。RPPAシグナル定量には昨年度作成した定量化ソフトウエアSupercurve GUIを使用した。その結果、凍結細胞由来タンパク質とFFPE細胞塊由来タンパク質の結果に相関が認められ（CC = 0.732）、EGFR-TKIに対する感受性についても予測された結果が得られた。以上の結果から、FFPE-RPPA解析のSOPｓを作成した。また、Supercurveの使用によって解析時間が短縮され解析作業ルーチン化の基礎が構築された。
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| Strategy for Future Research Activity |
先行研究において18種類の胸膜悪性中皮腫細胞株パネルの化合物ライブラリースクリーニングから、特定の薬剤に感受性のある中皮腫のサブグループがあり、感受性予測バイオマーカー候補を幾つか同定している。本年度は、xenograftモデルを用いて、本候補薬剤に対して感受性の高い細胞を移植し、投与実験を行い、摘出した腫瘍からFFPEブロックを作製し、昨年度までに確立したFFPE-RPPA法により、薬剤によるシグナル抑制効果を検討する。更に、バイオマーカー候補分子と腫瘍縮小効果の相関解析を行い、バイオマーカーとして妥当性を検証する。その結果に応じて、国立がん研究センターの病理部が保有するFFPE臨床検体で、RPPA解析を行いバイオマーカーの発現検証を行い、薬剤投与の可能性がある割合を明確にする予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は、前年度に購入した消耗品の余剰分を使用することができた為。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Early dynamics of circulating tumor DNA predict chemotherapy responses for patients with esophageal cancer.2021
Author(s)
Fujisawa R, Iwaya T, Endo F, Idogawa M, Sasaki N, Hiraki H, Tange S, Hirano T, Koizumi Y, Abe M, Takahashi T, Yaegashi M, Akiyama Y, Masuda M, Sasaki A, Takahashi F, Sasaki Y, Tokino T, Nishizuka S.
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Journal Title
Carcinogenesis
Volume: 42
Pages: 1239,1249
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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