不規則再生肝細胞に着目した新規肝癌バイオマーカーと創薬ターゲットの開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07706
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 山崎 元美 日本大学, 医学部, PD (40376794)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森山 光彦 日本大学, 医学部, 教授 (50191060) ; 黒田 和道 日本大学, 医学部, 研究員 (50215109)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 不規則再生肝細胞 / 肝癌

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、不規則再生細胞に着目して絞り込んだ肝癌発症候補遺伝子が慢性肝炎から肝癌までの新たなバイオマーカーや治療標的となりうるかを明らかにすることである。すでに、肝癌手術標本の癌部と非癌部において、LMDを用いたRNA-seqの結果から24個の肝癌発症候補遺伝子を同定し、その中から3つの肝癌発症候補遺伝子が臨床データ(血液データ、組織所見、予後や累積再発率など) と相関があることを見いだしている。既存の研究とは異なる視点から絞り込んだ24個の 肝癌発症候補遺伝子の発現を慢性肝炎の肝生検組織で検討し、慢性肝炎から肝癌に進行するものと、肝癌に進行しないものとを区別出来るバイオマーカーとして の可能性について検討する。
2021年度は、①絞り混んだ遺伝子の１つ(遺伝子A)について、侵襲性の少ない検体として血清を用いたELISA系を確立し、早期診断あるいは予後予測バイオマーカーとしての可能性を検討した。慢性肝炎の程度や慢性肝炎からの肝癌発症時に遺伝子Aが変動するかを検討した。②遺伝子Aについて肝癌手術標本を用いて、免疫組織化学染色(DAB)の系を確立した。同時に既存の腫瘍マーカーや増殖マーカーとの共局在を検討するために、蛍光免疫組織化学染色の系も確立した。遺伝子AとKi-67など5種類の既存腫瘍マーカーや増殖マーカーとの共局在を肝癌手術標本の癌部・非癌部(正常に近い部分)・非癌部(不規則再生細胞)の３つの部位で、遺伝子Aのタンパク発現を検討した。③遺伝子Aに着目し、癌部・非癌部(正常に近い部分)・非癌部(不規則再生細胞)について、新たにNGSでの検討を行なった。④遺伝子Aは癌組織で発現が上がっていることから、肝癌細胞株(HepG2、Huh7)での発現検討を遺伝子レベル(qPCR)とタンパクレベル(Western blot・蛍光免疫染色)で行なった。遺伝子AをsiRNAで発現抑制した時の影響をNGSで検討を行なった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2020~2021年度の2年間で、①絞り混んだ遺伝子の１つ(遺伝子A)について、侵襲性の少ない検体として血清を用いたELISA系を確立した。早期診断あるいは予後予測バイオマーカーとしての可能性を検討したが、血清では検出できないことが判明した。②遺伝子Aについて肝癌手術標本を用いて、免疫組織化学染色(DAB)の系を確立した。同時に既存の腫瘍マーカーや増殖マーカーとの共局在を検討するために、蛍光免疫組織化学染色の系も確立した。肝癌手術標本の癌部、非癌部(正常に近い部分)、非癌部(不規則再生細胞)の３つの部位で、遺伝子Aの発現を検討した。さらに、2022年度に予定していたKi-67など5種類の既存腫瘍マーカーや増殖マーカーとの共局在を検討した。遺伝子Aは癌部で高発現していること、非癌部でも不規則再生肝細胞で発現が高いことを確認した。また、一部の細胞では、既存の腫瘍マーカーや増殖マーカーと共局在すること分かった。③遺伝子Aに着目し、癌部・非癌部(正常に近い部分)・非癌部(不規則再生細胞)について、新たにNGSを行い、新たに16個の遺伝子を絞り込んだ。④遺伝子Aは癌組織で発現が上がっていることから、肝癌細胞株(HepG2、Huh7)での発現検討を遺伝子レベル(qPCR)とタンパクレベル(Western blot・蛍光免疫染色)で行なった。肝癌細胞株でも遺伝子Aが正常肝組織と比べて、発現が高いことがわかった。そこで、遺伝子AをsiRNAで発現抑制した時の影響をNGSで検討を行なった。
以上、４つの実験系全てがおおむね順調に進んでいると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、①絞り混んだ遺伝子の１つ(遺伝子A)について、侵襲性の少ない検体として血清を用いたELISA系を確立した。早期診断あるいは予後予測バイオマーカーとしての可能性を検討したが、血清では検出できないことが判明したため、血清中からExosomeを抽出し、検討を行う予定である。血清からのExosome抽出の系は、2020年度に確立しているため、速やかに実験を開始する予定である。②遺伝子Aについて肝癌手術標本を用いて、免疫組織化学染色(DAB)の系と既存の腫瘍マーカーや増殖マーカーとの共局在を検討するための蛍光免疫組織化学染色の系も確立し、癌部・非癌部(正常に近い部分)・非癌部(不規則再生細胞)の３つの部位で、遺伝子Aの発現を検討した。さらに、Ki-67など5種類の既存腫瘍マーカーや増殖マーカーとの共局在を検討した。遺伝子Aは癌部で高発現していること、非癌部でも不規則再生肝細胞で発現が高いことを確認した。また、一部の細胞では、既存の腫瘍マーカーや増殖マーカーと共局在することが分かったため、慢性肝炎、肝硬変、肝癌での発現を検討する予定である。③遺伝子Aに着目し、癌部・非癌部(正常に近い部分)・非癌部(不規則再生細胞)について、新たにNGSを行い、新たに16個の遺伝子を絞り込んだ。この16遺伝子について、癌部・非癌部での発現をqPCRで検討を行なう予定である。④遺伝子Aは癌組織で発現が上がっていることから、肝癌細胞株(HepG2、Huh7)での発現検討を遺伝子レベル(qPCR)とタンパクレベル(Western blot・蛍光免疫染色)で行なった。肝癌細胞株でも遺伝子Aが正常肝組織と比べて、発現が高いことがわかった。そこで、遺伝子AをsiRNAで発現抑制した時の影響をNGSで検討を行ない、現在、解析中である。遺伝子Aの発現抑制により細胞増殖能に影響を与えるかMTTで検討を行う予定である。

Causes of Carryover

購入予定であったprimerの設計が間に合わず、次年度に購入することにしたため